作者ct13732 (獨孤求敗)
看板Biotech
標題[求救] t a clone 問題
時間Tue Apr 28 11:30:28 2015
t a clone 實驗步驟 請教各位前輩
insert 1700bp 使用yeastern t and a vector 2728 bp
rt-pcr 產物 切膠 萃膠
開始做a tailing(使用phire 的tag )
5x GC buffer 6ul
2.5mM DATP 3ul
dna 含量 20ul 72c 30m, 12 overnight
phire 1ul
之後在使用 QIA quick pcr purifcation kit 純化後
檢測核酸的含量 OD value 約在35-55 ug/ml
ligation(使用biolabs t4 ligase)
ta vector 2(50ng)
t4 ligase 2
dna 3(150/55) 16 度 overnight
dw 補到20
t4 ligase 2
之前有測試過1:3 mole 1:3 1:5 重量比
發現在重量比的箘長的比較好 之前學姐也是如此
所以一直都是使用重量比 莫爾數比的箘很少
選用dh5-a competent cell 接5ul 增箘1.5hr 塗盤（lb+amp 100mg/ml ）
隔日進行colony pcr 選用13f+自行的primer
colony pcr 結果在目標的產物有很淺很淺的band 要肉眼看膠片才看得出來
但抽完plasmid 定序發現都沒有insert 進去 每次定序都是vector
箘長的50 個菌落以上（塗盤使用65ul）
但似乎都沒有insert 進去
想請教前輩 要如何知道是a tailing 成功？ 不然每次都重做一次很耗時
（我有大量的樣本）
我有請學姊跟我一起操作過 確認實驗技術沒有問題 用別的樣本也有成功
但是這一段就還沒有成功 卡關快半年了 覺得心灰意冷
想請問各位前輩有什麼要改進的地方？
若我實驗成功一定大大的感謝你
若你離我很近 請讓我請你喝新巴克QQ
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1F：推 williamyang: blunt end PCR產物推薦用pjet1.2 vector,很好用 04/28 11:58
2F：→ Ice9: 你的insert或vertor，得至少有一個5'-end有phosphate group 04/28 12:04
3F：推 smallhowhow: A tailing taq處理 72c 3hr 04/28 12:04
4F：→ Ice9: 另外，抽完 Plasmid 怎麼會直接拿去定序呢？跑個膠先看看才 04/28 12:09
5F：→ Ice9: 對啊。你insert：vector很接近，在膠體上很容易分辨出來的。 04/28 12:09
6F：→ Ice9: 還有，你在 ligation 步驟中，加了多少 ligase？ 04/28 12:14
7F：→ Ice9: 要不然就是使用會在 3'-end 自動加 a-tail 的 polymerase 04/28 12:17
8F：→ Ice9: 對了，也有可能是 ligase 的問題。ligase 非常 labile，以前 04/28 12:24
9F：→ Ice9: 實驗室剛買來，就先用冰的tube分裝4或5λ，編號冰起來，依序 04/28 12:29
10F：→ Ice9: 從-20℃取出使用。 04/28 12:31
11F：→ Ice9: 還有，ligase處理完，可以用65或72℃處理5 min…… 04/28 12:36
12F：→ Ice9: 最後，OD value 它就不會是濃度單位。你的敘述要再修改。 04/28 12:38
13F：→ blence: 這個protocol好奇怪,你有大量樣本更不需這麼麻煩的作法 04/28 13:14
14F：→ blence: 直接用pJET那套就省事多了 04/28 13:16
15F：推 jabari: 有錢買topo啊 QwQ 04/28 14:49
16F：→ ct13732: 回ICE9前輩 我加了2ul ligase，想請教抽完plasmid 跑膠是 04/28 17:14
17F：→ ct13732: 是用酵素re切跑膠麻？還有謝謝od的指正，我想表達的是濃 04/28 17:16
18F：→ ct13732: 度的部分，我使用的是pfu tag 所以需要加a tailing 04/28 17:19
19F：→ ct13732: 那我要怎麼確定我的產物端有磷酸化？ 謝謝前輩 04/28 17:22
20F：→ ct13732: 回williamyang blence 謝謝你的建議 因為這一方面的經驗 04/28 17:25
21F：→ ct13732: 驗沒有很多 我會好好研究一下 謝謝你們 04/28 17:26
22F：→ blence: 文中沒提,你的colony沒有藍白挑過？ 04/28 17:58
23F：→ ct13732: 回blence前輩 沒有 實驗室學姊的步驟就是我上面步驟的 04/28 19:33
24F：推 supray: PCR product 50ng/ul 取1ul跑膠 不會只有很淡的band 04/29 09:18
25F：→ supray: 或許你的產物不夠專一 04/29 09:19
26F：→ supray: 咦 我漏看了 怎不做藍白篩呢？ 04/29 09:23
27F：推 chaunen: 設計跨vector inser 的primer 做colony PCR 不然就藍白篩 04/29 17:46
28F：推 chaunen: 其實ligation完可以先PCR看看是否有接進去 04/29 17:51
29F：推 chaunen: 同步做先前成功的樣本 當做整個過程的postive control 04/29 18:22
30F：推 chaunen: 如果RT-PCR完的產物只有1種or目標產物最多 直接clean up 04/29 18:44
31F：推 chaunen: 甚至Pfu完直接加1ul taq 做3'端的A之後再clean up(要試) 04/29 18:55
32F：→ chaunen: 跑膠切膠的步驟應該是可以省略的 04/29 18:57
33F：→ chaunen: 很淡的band應該都是偽陽性 猜primer沒有跨vector& inser 04/29 18:59
34F：推 chaunen: 沾菌的時後取到微量塗盤時的linear vector 04/29 19:08
35F：→ ct13732: 回前輩chaunen 謝謝你的建議 我會先ligation 跑跑看 05/01 16:51
36F：推 tigernaxo: 要不要試試用kinase處理insert 05/01 22:47