作者s64123 (嘿嘿)
看板Biotech
標題Immunofluorescent 一直染不出來
時間Sun Apr 26 16:27:53 2015
想詢問各位大大
冷凍切片後
我染特定細胞的 receptor (tyrosine kinase receptor)
但染完都沒有我要看得細胞
應該說 POSITIVE 跟 NEGATIVE 是同樣亮度的
步驟如下
0.01 M PBS wash 5min*3
2% NGS-0.1% BSA- 0.2% Triton blocking 5 mins
10 % NGS-0.1% BSA- 0.2% Triton blocking 20 mins
0.01 M PBS wash 5min*3
add primary antibody overnight at 4 度C
0.01 M PBS wash 5min*3
add secondary antibody 30 mins
0.01 M PBS wash 5min*3
coverslip
一抗是新買的
想請各位知道哪裡出問題嗎?
感謝 > <
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除
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1F：→ stone1105: 1跟2抗濃度是? 有時候抗體濃度調整一下會好很多 04/26 17:05
2F：推 bpjp: 二抗之後有嚴格避光嗎？你沒寫到 04/26 21:14
3F：推 bpjp: 不對，有亮就跟避光沒關係了 04/26 21:15
4F：推 tz2733: 為何使用triton? 要染的蛋白在細胞內? 04/26 21:38
5F：推 tynse71864: 丟一抗之後的wash 我都會用PBST耶 04/26 23:27
6F：→ tynse71864: 你的negative ctrl是 只有二抗 還是加IgG 04/26 23:28
7F：→ s64123: 加二抗 04/27 08:16
8F：推 Tubar: 1.可能你的一抗efficiency不好，好的抗體讓你上天堂，爛抗 04/27 10:15
9F：→ Tubar: 讓你染到頭抱著燒 2. 可能此細胞內receptor表現量少，所以 04/27 10:15
10F：→ Tubar: 你會看不到，可以試試市面上放大訊號的KIT 04/27 10:15
11F：→ blence: 推樓上,原po未提及此一抗用在IF是已知的,也未說明postive 04/27 11:01
12F：→ blence: 是否來自已知的細胞,這兩個因素比調整condition來得重要 04/27 11:02
13F：→ s64123: 但很多文獻資料都表示此一抗是確定可以染出我要的細胞的 04/27 11:09
14F：推 Tubar: 你目前的做法看起來沒有太大的問題，我認為主因還是在Ab和 04/27 12:23
15F：→ Tubar: Ag上，朝這兩個方向去做troubleshooting 04/27 12:24
16F：→ s64123: 謝謝大家 04/27 13:05
17F：→ ad1980: 一抗有用在 WB 上試過嗎？ 04/30 02:27
18F：→ s64123: 有 很明顯!! 05/01 22:13
19F：推 jabari: 要說細一點的話..你用了triton破膜 但後面沒用tween20讓 05/02 16:52
20F：→ jabari: 孔洞維持..可以洞洞縮起來了?? 05/02 16:52