作者shunminhsu (sharkhsu)
看板Biotech
標題[討論] Gibson Assembly 無法成功接上
時間Sat Mar 28 11:40:16 2015
目前打算將vector和insert利用Gibson Assembly接上，再transform
到DH5a，但沒想到塗盤後都沒有長任何菌。因此想要請問各位有嘗試
過此法的人，有沒有什麼經驗、方法可以提出來參考的呢!?
primer設計完，並利用snapgene確認可ligation後，
把vector double digestion(NcoI、DraIII)、insert 分別切膠純化
vector 長度為3200bp、insert為2500，兩者跑膠確認無誤。
按照NEB的protocol :
vector 實驗中加入 2μl (50ng)
insert 4μl (150ng)
Gibson buffer 10μl
DIW 4μl
--------------------------
Total : 20μl
之後再50℃反應15 min → -20 ℃保存，以準備transform用。
Transformation :
上述溶液稀釋4倍，將2μl加入50μl的勝任細胞，混合完冰浴30moin
→42℃熱休克30 s → 冰浴2 min → 加入950μl LB後於37℃培養1hr
→ 200 μl菌液 塗到palte上(抗amp) → overnight培養
----------------------------
步驟大約如上，但還是沒有長任何菌 ..之前有將gibson完的溶液跑膠，
卻只有看到2800 bp的一條band，也不曉得問題出在哪! ..
可否請高手分享相關的經驗呢!?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.35.165.133
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1427514019.A.906.html
※ 編輯: shunminhsu (114.35.165.133), 03/28/2015 11:41:19
1F：→ Ice9: 切膠純化是用什麼方法？最後 DNA 回溶在什麼 buffer 中？ 03/28 18:47
2F：推 Ice9: 跑膠圖片可以放上來嗎？只有一條band表示另一段壞光了？ 03/28 18:59
呃. . 步驟主要是利用binding buffer將膠片溶完後，再利用spin column和washing buffer
洗淨。 回溶是用EB .. 目前身上沒有膠片圖 囧" 對於另一段壞光目前是沒有想法..
畢竟分開跑都有band .. 但一起跑就出現2800bp，最有可能就是此產物為線性...
※ 編輯: shunminhsu (36.239.40.203), 03/28/2015 20:21:47
3F：推 Invec: 兩片段請用水回溶 50度C作用完的產物直接取10ul去轉 03/29 00:34
謝謝您的建議，我會再試試看
4F：推 penguinbb: vector cutting離recombine的地方多遠？我之前經驗是若 03/29 00:35
5F：→ penguinbb: 兩者離得太遠(>幾十bp)enzyme作用時間要長一些才能成功 03/29 00:36
6F：推 penguinbb: *cutting site 03/29 00:42
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 03/29/2015 08:21:39
7F：→ Ice9: 我没用過這Gibson Assembly。Invec和penguinbb的方法都很實 03/29 10:58
8F：→ Ice9: 用，畢竟你的 insert 頗大。或許作用時間加長會有效。DNA 回 03/29 10:59
9F：→ Ice9: 溶最好是在水中，以免 buffer 影響酵素活性。如果怕量不夠， 03/29 11:01
10F：→ Ice9: 可以一開始就用大一點的量。另外，以前傳統方法中，ligase 03/29 11:02
11F：→ Ice9: 作用時都會加ATP，作用後也會放72℃來 heat inactivated。可 03/29 11:03
12F：→ Ice9: 以增加點 transformation 的成功率。 03/29 11:04
13F：→ davidhthy: 好奇問72℃ heat inactivated效果會好到有差異嗎@@ 03/29 19:56
14F：→ davidhthy: 是為了不讓ligase不亂抓plasmid?? 03/29 19:57
15F：→ Ice9: 記得 datasheet 上寫 10%。但没有仔細比較過。 03/29 23:32
16F：→ Ice9: 我剛剛看過 protocol，計算了一下你初始 DNA 的量。似乎少了 03/30 00:14
17F：→ Ice9: 一到兩個數量級。另外，50℃作用可以再延長些。 最後再問一 03/30 00:15
謝謝ice大熱情的回答，因為protocol上建議vector的量大約在50-100ng之間，所以
我才加50ng進去，insert是建議>vector2倍以上，所以才加150ng...。
目前只能先試試看將片段回溶於水中和拉長反應溫度了。
18F：→ Ice9: 你的 DIW 是什麼？廠商没賣這東西啊。 03/30 00:16
19F：→ blence: DIW(deionized water)不少cloning jit會附 03/30 00:30
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 03/30/2015 08:53:06
20F：推 silverberry: 最近做了兩個 constructs (7+7.8/7+4.3 kbp) 04/16 13:29
21F：→ silverberry: 我同時用 Gibson Assembly 和 In-fusion 做， 04/16 13:29
22F：→ silverberry: 結果 in-fusion 大勝。目前正在等定序結果。 04/16 13:30
23F：→ silverberry: 如果你的 overlap 是 15 bp 的話可以考慮換 kit 試試 04/16 13:31