作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
標題[求救] stable clone建立
時間Sun Mar 22 22:43:24 2015
各位版友們好
老闆要求我在小鼠小腸上皮細胞的cell line中
用transfect方式來overexpress我要看的protein
老闆教的方法是:
1.transfect 24hr 後 分成6盤並加入puromycin 2ug/ml(已確定濃度殺的死
2.selection 約2周
3.直到可用肉眼從10cm plate 底下看到細胞團時
用3~4ul的trypsin 把該細胞團上下pipeting吸起來
轉移至24well 中 (這個細胞不容易長成一大坨疊起來 會聚成一片
所以pipet時蠻容易吸到旁邊的colony
4.養到6 well後 收lysate與做stock
此時的western結果都清楚的 會有一個很強的band
問題來了
當我重新thaw out這些cell stock時，會持續養在1ug/ml的puro-DMEM中
(老闆跟學長說可以
但養了幾代後 我的western表現量就越來越低了 之後就沒表現了...
於是做了limit dilution 終於拿到有表現的細胞(只有1個clone
而且目前養了2~3個月都沒有掉
做growth curve結果是 overexpress這個protein會讓細胞長的比較慢
由於只有一個clone 老闆希望可以duplicate
因此我又重新transfect 要挑stable clone
結果還是一樣....thaw out後養了幾代western就沒看到表現了
而且幾乎是0表現 所以limit dilution(正在做 但不太覺得養得出有表現的)
老闆一直覺得是我lysis buffer配錯導致protein lysis不出來
我從NP-40-->TX 100--> RIPA(NP40+DOC+SDS)一直換
他覺得我lysis buffer由於另外加了inhibtor
所以NP40濃度會從1%--->0.95% 導致protein lysis 不出來
而我自己是覺得 會不會我挑single colony時 本來就不是single來源
而且有表現蛋白的細胞又長比較慢 所以就慢慢被埋沒了
為了建立這個stable clone 半年都快過去了
看著同學的data一直生 自己卻一直卡在這裡 有點崩潰阿...
有沒有什麼挑stable clone的建議呢?
是該在最前面transfect後 直接做limit dilution
以確保clone是單一來源嗎? 還是有其他建議 謝謝QQ
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※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1427035407.A.713.html
1F：推 tsubasawolfy: 如果那麼確定該蛋白oe會影響細胞生理 怎麼不改誘導03/22 23:17
2F：→ tsubasawolfy: 型表現呢03/22 23:17
3F：推 ararthur: 1%換成0.95%就會lyse不了...是不是你老闆在搞你啊03/22 23:58
4F：推 ararthur: protein lysate跑其他蛋白 例如internal ctrl呢 有嗎?03/23 00:00
5F：→ ararthur: 如果有那就不會是lysis不完全阿03/23 00:01
6F：→ ararthur: stable clone常常會跑掉 特別是凍了以後 我有做過transf03/23 00:01
7F：→ ararthur: -ect後凍起來就會死掉的細胞... 不行就建議密集把實驗做03/23 00:02
8F：→ ararthur: 完不要仰賴凍起來的stock吧03/23 00:02
to T大：我有想過但沒跟老闆提 他應該會說：“沒這個必要吧？”
是說induced的有什麼好處嗎？
to A大:我的細胞STOCK後不會什麼死 (超會長) 但表現真的會大下降
因為實驗室只有我一個人在用這種細胞 所以問誰都不知道
我試試看細胞一直養到實驗做完吧 (前提老闆要同意...
另外internal ctrl很正常 我去lyse 之前LD挑出來的clone表現也正常
是新挑的都不表現了 所以我覺得不關lysis bfr的事...
但老闆就要我一直重跑western (ry
※ 編輯: tynse71864 (123.194.138.71), 03/23/2015 01:19:05
9F：→ blence: 用lysis buffer的理由好像有點瞎?03/23 09:01
10F：→ blence: 如果要重挑,在puro接近穩定之後種到極稀釋,就不會難挑了03/23 09:04
是puro篩個10天左右 繼續用原來的plate 種到很稀； 還是改種96well呢？
※ 編輯: tynse71864 (42.66.40.126), 03/23/2015 11:25:14
11F：推 tsubasawolfy: lysis buffer理由超瞎所以完全不想理 03/23 14:26
12F：→ tsubasawolfy: 如果你要繼續挑的話看要不要增加一點puro的量 03/23 14:26
13F：→ tsubasawolfy: 接著因為細胞特性的關係不要養到肉眼可見 03/23 14:27
14F：→ tsubasawolfy: 顯微鏡下可看到一團形成時用glass cylinder挑 03/23 14:28
15F：→ tsubasawolfy: 至於會不會碰到其他的colony...transfection後分稀 03/23 14:30
16F：→ tsubasawolfy: 一點讓各colony距離大一點03/23 14:30
※ 編輯: tynse71864 (42.66.40.126), 03/23/2015 16:14:10
17F：→ Ice9: 若没有 glass cylinder，可以自已切 tip 的頭……另外，可以 03/24 17:20
18F：→ Ice9: 削尖 tip 尖端用來挑起 colony。 03/24 17:21
19F：推 yuyu219: 比較建議解凍後先用較高濃度的puro，穩定後再調低。如果 03/26 22:46
20F：→ yuyu219: 繼續被老師懷疑lysis buffer，你就sonication給他看，不 03/26 22:46
21F：→ yuyu219: 相信protein沒有出來 = = 03/26 22:46
to 塔芭莎大(?) 跟ice大: 這樣的話我應該就要在非hood下進行挑細胞了耶
這樣好嗎 (因為曾經長fungus過...) 我在想想有沒有折衷的辦法
其實會用固定濃度PURO去篩 其一是我之前測試過該濃度可殺死
其二是我拿到的Vector 建議transfect selection就是該濃度
所以我一直沒有去調puro 的濃度
我lysis細胞會vortex 5次耶XD 所以該出來的應該都出來了(吧
不然就是degrade光了...
※ 編輯: tynse71864 (123.194.138.71), 03/26/2015 23:13:45
22F：→ Ice9: 不是肉眼可見嗎？ 在顯微鏡下先在dish背面點一下相對位置， 03/27 13:20
23F：→ Ice9: 再回到 hood 中操作啊。 03/27 13:21
24F：→ Ice9: 肉眼可見的 colony 中雖然可能還有一部分 03/27 13:22
25F：→ Ice9: 可能含有還未死透的細胞，但比一開使用trypsin沖刷的強一點 03/27 13:24
26F：→ zoe77101y: 跑看看PCR,會不會只有在基因上只有差異，蛋白不太明顯 04/09 01:30
27F：→ zoe77101y: ！？ 04/09 01:30