作者swoopsky (楊P)
看板Biotech
標題[求救] siRNA transfection問題
時間Sat Feb 21 15:29:53 2015
各位大大好，目前在做siRNA transfection的實驗，
的是為了要驗證用meta-analysis 找出的基因是可信的。
但最近試了幾次不同siRNA的濃度，效果一直不穩定QAQ。
[細胞株]: MCF-7 和 MDA-MB-231
[siRNA]: IDT DsiRNA (27 mer)
[transfection reagent]: lipofectamine (invitrogen)
[實驗步驟]: (目前是測試siRNA的濃度哪個較好)
[測試siRNA濃度為 30nM 20nM 10nM]
使用6 well 來進行實驗，每一個well最後medium體積為 1.5 ml。
{siRNA}
1. 先由 20uM siRNA (stock)取出後加入serum及antibiotic-free medium
做成 300 nM siRNA 靜置5-10分鐘後在序列稀釋成 200 nM 以及 100 nM siRNA
(因之後再加入MEDIUM會將siRNA濃度稀釋10倍變成預測試的30,20,10nM)
{lipofectamine}
2.做出比例為 5ul lipofectamine in 150ul serum及antibiotic-free medium 的stock
(也是有靜置5-10分鐘)
{siRNA/lipofectamine}
3.在150ul 300nM, 200nM, 100nM siRNA中
各加入transfect reagent 150ul(含5ul lipofectamine)
並靜置25-30分鐘 (此時為300 ul 混和液)
{add in 6 well}
4. 將前一天已貼在6 well的cell (滿度7-8成)，
將舊的medium(含serum和antibiotic)移除，加入1.2 ml serum&antibiotic-free medium
5. 再將300 ul siRNA-lipofectamine 加入
6. incubate 24h後換回正常medium (10% FBS & antibiotic)再incubate 24h
7.抽RNA 轉cDNA 測qPCR 看transfect基因的表現量變化。
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整個實驗流程大致如上，
但測出來的結果有時siRNA濃度低的組別，基因表現量比濃度高的低....
不曉得是不是上述步驟那些不妥(因實驗室沒人做過，而我本身大學也不是生物背景)
另外有看到有人說transfection前不可以換medium，不曉得是不是就是我的步驟QQ
請各位大大幫忙QAQ
這部分測完要在後續做cell migration & invasion的實驗.....
謝謝>"<
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※ 編輯: swoopsky (111.248.206.128), 02/21/2015 15:32:25
1F：→ blence: 後面還沒看,看到你選用的cell,你應該沒測試過transfec效率 02/21 19:59
2F：→ blence: 第二會猜想你還未保證該si是可用的,怎先猜transfection? 02/21 20:03
3F：→ swoopsky: Transfect效率有看過是用螢光的方式測，但實驗室沒有買 02/21 22:10
4F：→ swoopsky: 這樣的reagent... 02/21 22:10
5F：推 mesenchymal: 跟別的實驗室借GFP plasmid試試 02/22 09:40
6F：推 datro: siRNA 用一般送plasmid的試劑做效率都不太好 有專用的試劑 02/26 00:27