腦補 默默的覺得你的vector可能有一個點換錯地方了XD chromosome被重組 所以有抗性 但是p不出來 可以多用幾組primer交叉測試一下 或是看一下crossover的點有沒有辦法在genome裡面blast到其他東西 然後mycycler好像要升級才能用gradient 問問你們經銷商吧 ※ 引述《licat (licat)》之銘言： : ※ 引述《polomi (polomi)》之銘言： : : 去除的片段長度約為450 bp， : : 而使用插入取代的抗性片段約為1.6 KB。 : 那你原本設計用來確認重組狀況的primer，離置換位置有段距離 : 會讓PCR困難度變高，可以考慮設計得近一點 : (不過看你PCR的圖，這應該不是做不出來的主因) : : 利用kanamycin 15ug/ml， : : 互換的機制是同源重組交換的方式。 : : 有一個大陸的網站寫得滿淺顯易懂的， : : http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology : : 主要的參考是這篇paper : : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079 : 我用過這個系統，跟其他互換系統相比沒那麼順利 : 雖然看起來很簡單但不容易除錯，DNA電進去後都不知道出了啥事 : 如果你能找到用得很順的人，建議直接跟他請教 : 如果周圍沒有，而你又是作E. coli，我覺得你換用SacB系統做還比較好 : : 各加上目標取代位置前後各50bp送入。 : : 主要送入方式都是以電穿孔的方式。 : : 　 : : 因主要表現重組蛋白的質體為溫度敏感型， : : 過程中都有注意培養的溫度是否有低於30度。 : : 那個我有取只含有重組蛋白質體的菌來pcr過， : : 用原本的primer表現， : : 的確原本的片段長度約為1KB左右。 : : 應該可以初步排除雜菌的可能性。 : 以上所述是無法排除的啦 : 但我猜那些菌落還是你的E. coli，而且有發生重組所以才有Km抗性， : 然後你的PCR也才會變成作不出來 : 只是重組方式跟原本預期的不一樣... : : 恩我用附圖的方式可以嗎? : : http://ppt.cc/5iBm : : 請原諒我必須刪掉我的目標序列名稱。 : : 　　 : : 阿~~~ : : 希望不要阿。 : : 我連發票都是一整年頂多中一張200的機會啊 QAQ : 這跟機率無關，你應該找有經驗的人幫你看一下整個互換設計跟引子位置是否正確 : : 　 : : 其實原先主要的annealing溫度為58度， : : 現在有嘗試過， : : 50 55 58 60 62 64， : : 主要都是30秒。 : : 也有嘗試著加入DMSO， : : 其結果如下圖: : : http://ppt.cc/C99u : : 感謝您， : : 我會先嘗試著降低溫度試試看～ : 嗯...多了解後，我覺得改PCR條件的成功機率不高，但還是祝你好運 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.60.93 ※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1423794913.A.C8F.html