不好意思， 打擾了~~ 其實我是使用這個KIT組 Ecoli Gene Deletion Kit http://www.genebridges.com/products/quick-easy-e-coli-gene-deletion-kit ※ 引述《lchd (...)》之銘言： : 最近也用過這個方法,做了幾個KO strain : 應該可以給你一些建議 : 看起來primer ok, 我覺得不是PCR的問題,而是沒有成功的菌落產生 : 且如板友所說genomic DNA萃取可能也有問題, : 不過我認為還是把心力花在提高成功率吧 : 我覺得你可以從幾個方向著手修改試試看 : 1.送進去的DNA濃度 : 看你之前的文章,似乎在切膠純化的時候就已經濃度不高了 : 可以的話盡量讓純化出來的濃度約50-100ng/ul,成功率會較高 因為之前一直無法成功P出所想要的序列， 所以就直接向廠商訂做了所需要的取代序列。 在訂做前，也有向kit的原廠詢問相關序列的設計問題。 原廠表示序列的設計方式沒有錯誤。 每次實驗添加1.5 ul 約為350ng的量。 : 2.Kanamycin plate : 有版友提到,可以試著提高一下plate的濃度, : 就我的經驗 15ug/ml太低了 之前有提高到大約30ug/ml， 主要是挑菌後篩選的。 : 你也可以把現在挑到的菌用LB+Kanamycin 液體培養一天看看, : 測試是不是真的有抗K 現在做的大多是挑clon後液態培養一晚， 在抽genomic DNA做PCR。 : 3.Control 有做嗎？: 沒有電DNA的菌,跟實驗組等量塗在你的15ug/mL k plate上 : 如果也長很多的話,那就不用繼續P下去了 有利用原廠附的比較菌種做測試， 原始菌種也有測試過不帶任何抗性。 : 4.查一下colony PCR吧,比較快也可以多篩幾顆菌落,不需要抽完genomic DNA才做PCR 小弟大蓋已經挑了20顆以上， 想請問clony PCR的溫度時間是否要再提高? : 5.幾個雜項,arabinose有加嗎？,competent cell濃度夠嗎？電完菌的recover 時間? 確定添加50 μl 10 % L-arabinose 每次電穿孔前有先測量OD600 約為0.5 培養了4小時的時間。 : 加油,祝你好運 最近有更改一下PCR的條件， 第一步， 94度 5分鐘。 第二步， 94度， 30秒。 56度， 60秒。 68度， 2分30秒。 第三部， 68度， 7分鐘。 然後試了兩家不同的polymerase。 這是這次的結果。 http://ppt.cc/utTT 在2~3K位置似乎有些band出現了。 (希望不是錯覺。 我想過個好年阿 QAQ...) 最前面那兩管是我取原本的未經任何修飾的菌種做PCR的嘗試， 請問是否有方法可以提高專一度? 感謝各位大大了 也感謝大家給的建議~~ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.107.165.123 ※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1423794853.A.306.html