※ 引述《polomi (polomi)》之銘言： : ※ 引述《licat (licat)》之銘言： : : 不好意思因為資訊太少，我想問一些問題便於判斷 : : 　請問想去除的片段長度多大？ : 去除的片段長度約為450 bp， : 而使用插入取代的抗性片段約為1.6 KB。 那你原本設計用來確認重組狀況的primer，離置換位置有段距離 會讓PCR困難度變高，可以考慮設計得近一點 (不過看你PCR的圖，這應該不是做不出來的主因) : : 請問是甚麼抗生素基因？使用的互換機制是？ : 利用kanamycin 15ug/ml， : 互換的機制是同源重組交換的方式。 : 有一個大陸的網站寫得滿淺顯易懂的， : http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology : 主要的參考是這篇paper : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079 我用過這個系統，跟其他互換系統相比沒那麼順利 雖然看起來很簡單但不容易除錯，DNA電進去後都不知道出了啥事 如果你能找到用得很順的人，建議直接跟他請教 如果周圍沒有，而你又是作E. coli，我覺得你換用SacB系統做還比較好 : 各加上目標取代位置前後各50bp送入。 : 主要送入方式都是以電穿孔的方式。 : 　 : 因主要表現重組蛋白的質體為溫度敏感型， : 過程中都有注意培養的溫度是否有低於30度。 : : 　我覺得不像是PCR或抽DNA的問題， : : 　因為你的control反應很專一，這種PCR你沾一點菌落或菌液直接當模板都做得出來 : : 　 : : 　所以你沒夾出來，我覺得比較可能是 : : 　1. 那些長出來的菌落是污染的雜菌，沒有你primer可認得的序列 : : 　　 （如果你提供詳細實驗流程跟結果： : 那個我有取只含有重組蛋白質體的菌來pcr過， : 用原本的primer表現， : 的確原本的片段長度約為1KB左右。 : 應該可以初步排除雜菌的可能性。 以上所述是無法排除的啦 但我猜那些菌落還是你的E. coli，而且有發生重組所以才有Km抗性， 然後你的PCR也才會變成作不出來 只是重組方式跟原本預期的不一樣... : 恩我用附圖的方式可以嗎? : http://ppt.cc/5iBm : 請原諒我必須刪掉我的目標序列名稱。 : 　　 : : 　2. 那些菌落都是insertion mutants，然後你primer座落的位置被互換掉了 : : 　　 （這得看primer座落位置跟整個互換的設計） : 阿~~~ : 希望不要阿。 : 我連發票都是一整年頂多中一張200的機會啊 QAQ 這跟機率無關，你應該找有經驗的人幫你看一下整個互換設計跟引子位置是否正確 : 　 : : 　3. 那些菌落都是insertion mutants，primer也沒錯， : : 　　 但PCR反應沒有強到可以夾出2 KB大小，所以你可以： : : (1) 將annealing降到50，沒出來再降到45，再沒出來就放棄 : : (2) 換別的廠牌的taq，直接測試50跟45度annealing : : (3) 重新設計其他primer : : 　　 : 其實原先主要的annealing溫度為58度， : 現在有嘗試過， : 50 55 58 60 62 64， : 主要都是30秒。 : 也有嘗試著加入DMSO， : 其結果如下圖: : http://ppt.cc/C99u : : 　　 我想你可以先測試上述的PCR條件， : : 　　 希望你annealing溫度一降就夾出來，問題解決~ : : 祝實驗順利 : 感謝您， : 我會先嘗試著降低溫度試試看～ 嗯...多了解後，我覺得改PCR條件的成功機率不高，但還是祝你好運 --

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