※ 引述《licat (licat)》之銘言： : 不好意思因為資訊太少，我想問一些問題便於判斷 : 　請問想去除的片段長度多大？ 去除的片段長度約為450 bp， 而使用插入取代的抗性片段約為1.6 KB。 : : 是對genomic DNA上的目標基因利用一段具有抗生素抗性基因做取代。 : 請問是甚麼抗生素基因？使用的互換機制是？ 利用kanamycin 15ug/ml， 互換的機制是同源重組交換的方式。 有一個大陸的網站寫得滿淺顯易懂的， http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology 主要的參考是這篇paper http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079 : 　（抗生素基因是帶在質體上？或著你送入的是線狀DNA？） : 然後你應該是使用在抗生素盤上長出來的菌落去抽DNA、做後續PCR吧？ 送入的抗性基因是線狀的DNA， 主要設計是在取代用的抗kanamycin基因序列前後， 各加上目標取代位置前後各50bp送入。 主要送入方式都是以電穿孔的方式。 　 因主要表現重組蛋白的質體為溫度敏感型， 過程中都有注意培養的溫度是否有低於30度。 : : 是不是要再另外購買什麼或是連絡廠商才能打開機器的權限? : 　我覺得不像是PCR或抽DNA的問題， : 　因為你的control反應很專一，這種PCR你沾一點菌落或菌液直接當模板都做得出來 : 　 : 　所以你沒夾出來，我覺得比較可能是 : 　1. 那些長出來的菌落是污染的雜菌，沒有你primer可認得的序列 : 　　 （如果你提供詳細實驗流程跟結果： 那個我有取只含有重組蛋白質體的菌來pcr過， 用原本的primer表現， 的確原本的片段長度約為1KB左右。 應該可以初步排除雜菌的可能性。 還未定序過，也有可能是其他的雜菌。 : 　　 像是怎麼送入DNA？塗盤後生長菌落數？會比較好判斷） 都是使用電穿孔的方式， 恩我用附圖的方式可以嗎? http://ppt.cc/5iBm 請原諒我必須刪掉我的目標序列名稱。 　　 : 　2. 那些菌落都是insertion mutants，然後你primer座落的位置被互換掉了 : 　　 （這得看primer座落位置跟整個互換的設計） 阿~~~ 希望不要阿。 我連發票都是一整年頂多中一張200的機會啊 QAQ 　 : 　3. 那些菌落都是insertion mutants，primer也沒錯， : 　　 但PCR反應沒有強到可以夾出2 KB大小，所以你可以： : (1) 將annealing降到50，沒出來再降到45，再沒出來就放棄 : (2) 換別的廠牌的taq，直接測試50跟45度annealing : (3) 重新設計其他primer : 　　 其實原先主要的annealing溫度為58度， 現在有嘗試過， 50 55 58 60 62 64， 主要都是30秒。 也有嘗試著加入DMSO， 其結果如下圖: http://ppt.cc/C99u : 　　 我想你可以先測試上述的PCR條件， : 　　 希望你annealing溫度一降就夾出來，問題解決~ : 祝實驗順利 感謝您， 我會先嘗試著降低溫度試試看～ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.107.165.123 ※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1423705236.A.612.html