作者polomi (polomi)
看板Biotech
標題Re: [求救] 有關PCR的問題
時間Wed Feb 11 09:37:54 2015
※ 引述《polomi (polomi)》之銘言：
: 版上大家好~
: 小弟目前正在進行有關E. colo同源重組的實驗，
: 最終的確認是使用PCR判斷有無成功的插入到genomic DNA上。
: 如果是失敗的會保留原長度約為1.1KB，
: 成功的話會改變其長度。
: PCR都是使用相同的primer跟相同的溫度條件設定。
: 萃取完DNA後，
: 也有使用DNA clean kit做純化的動作。
: 有測量OD260/280算濃度。
: 每管每次PCR添加的genomic DNA template都固定約為200~300ng。
: 使用的polymerase為 ACCU DNA polymerase。
: http://www.yeastern.com/Products.php?pid=169&pkid=10&pttype=60
: 按照原廠建議使用。
: primer最終濃度為0.2uM
: dNTP 最終濃度為 0.1mM
: 每次都固定50ul
: 可是最近幾次的PCR都無法出現結果。
: 有使用先前成功的template做對照。
: 有附圖說明，請參考。
: http://ppt.cc/to8T
: 均為同時跑PCR的結果。
: PCR buffer是先除去template跟polymerase外先混合均勻，
: 再分別添加的。
: 各項溫度的設定並未改變。
: 請問我有哪裡需要再做改變的?
: 麻煩各位了
不好意思，
可能小弟上次說的不夠清楚。
因為目前正在做E. coli同源重組的實驗，
是對genomic DNA上的目標基因利用一段具有抗生素抗性基因做取代。
所以，
如果取代失敗的話，
用原本的primer去PCR的話，
應該還是原本的片段長度。
而如果取代成功，
片段長度會有所改變。
而預估如果成功的取代了原本的目標基因片段，
會從原本的1KB多變成約2KB左右的長度。
如果取代失敗的話，
PCR的結果會直接呈現1KB的band出現，
但是目前的結果PCR後完全沒有任何的band產生。
小弟有做了比對的組別，
如圖，
http://ppt.cc/to8T
應該可以證明PCR的polymerase與primer沒有問題。
是不是要對PCR的其他溫度條件與時間做改變。
目前的PCR溫度設定條件如下:
第一步:
94度C， 5分鐘。
第二步:
94度C， 30秒。
58度C， 30秒。
68度C， 2分30秒。
第三步:
68度C， 7分鐘。
結束。
使用的PCR儀器為BIO-RAD My Cycler。
請問，
如果從原先的1點多KB片段長度變成2點多KB，
是不是要修改那些PCR條件。
已經有嘗試過將annealing 溫度從58調整為 60 62 64過。
也有嘗試著將低到55。
但似乎都還是只有比對用的有成功產生band出現。
順帶請問一下，
請問這台PCR如果要做梯度溫度的分段PCR，
是不是要再另外購買什麼或是連絡廠商才能打開機器的權限?
感謝大家。
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1F：推 mesenchymal: 題外話: 也可以針對你換進去的片段設計primer 02/11 12:27
2F：→ mesenchymal: 例如F-primer target是Genomic, R-primer則是抗生 02/11 12:29
3F：→ mesenchymal: 素基因 02/11 12:30
4F：→ scherzoinb: 挑幾個菌去送定序吧~~~ 02/11 14:07
5F：→ scherzoinb: 你有沒有想過會不會是萃取的問題？ 02/11 14:08
6F：→ scherzoinb: 所以才會建議你直接用菌下去p~~~原po加油~~~~~~ 02/11 14:09
7F：→ scherzoinb: 再仔細看看primer夾的位置跟取代位置的關係~~~ 02/11 14:11
8F：→ polomi: 不好意思 想請問 直接用菌下去P的條件要如何控制? 02/11 15:19