※ 引述《silverberry (平行線上的交集....)》之銘言： : 大家好，標題用閒聊是想聽聽大家的意見。 : 如果不合適的話請告訴我，我會修改 m(_ _)m : 我的實驗室最近想要開始使用 CRISPRC/Cas9， : 除了從 addgene 買了相對應的 vector， : 為了快速地確認這個技術在實驗室是成功的， : 我們決定先把有 stable eGFP transfect 的細胞裡的 eGFP 做 deletion。 : 根據 gRNA 設計的原理， : 最後挑了四個 gRNA : gRNA1 gRNA2 : 5'-nnnnnnnnnn 我是 eGFP nnnnnnnnnnn-3' : 3'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-5' : gRNA3 gRNA4 : gRNA1,2 是根據 (+) strain 設計的 : gRNA3,4 是根據 (-) strain 設計的 : 為了確定可以把 eGFP 去掉， : 除了一定要的 Cas9 以外， : 打算做 gRNA1+gRNA2 : gRNA1+gRNA4 : gRNA3+gRNA2 : gRNA3+gRNA4 四組 co-transfection : 然後再看看哪一組都不亮了、並配合 FACS 跟 genomic DNA PCR 確定真的成功了。 : 設計這四組 co-transfection，合理嗎? : 還是我們想太多了? : 雖然很可能試了才知道怎麼會成功， : 不知道有沒有人可以分享一些經驗^^ : 謝謝 m(_ _)m 首先，利用Cas9破壞EGFP表現的原理是造成insersion or deletion 然後讓EGFP序列發生frameshift，破壞正常胺基酸序列 但有時候Cas9造成的insersion or deletion恰好是3n，所以inframe的結果是EGFP繼續亮 其次，因為是transient表現的細胞，所以plasmid在細胞的copy number比較多 就算Cas9逃過了第一點，也很可能因為只切了30%的plasmid，所以EGFP繼續亮 所以，我擔心你的實驗設計無法告訴你太多資訊 比較好的做法是找一個endogenous gene 利用T7E1 assay確定efficiency就好 這樣才有機會比較快知道這套系統能不能在貴實驗室作用 我自己是用這個方法進行，也沒有什麽太大的問題 比較多的經驗是做成conditional KO mice及point mutation KI mice 如果大家有興趣，我們可以再討論 --

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