作者silverberry (平行線上的交集....)
看板Biotech
標題[閒聊] Genome editing - CRISPR/Cas9
時間Fri Jan 23 13:47:37 2015
大家好，標題用閒聊是想聽聽大家的意見。
如果不合適的話請告訴我，我會修改 m(_ _)m
我的實驗室最近想要開始使用 CRISPRC/Cas9，
除了從 addgene 買了相對應的 vector，
為了快速地確認這個技術在實驗室是成功的，
我們決定先把有 stable eGFP transfect 的細胞裡的 eGFP 做 deletion。
根據 gRNA 設計的原理，
最後挑了四個 gRNA
gRNA1 gRNA2
5'-nnnnnnnnnn 我是 eGFP nnnnnnnnnnn-3'
3'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-5'
gRNA3 gRNA4
gRNA1,2 是根據 (+) strain 設計的
gRNA3,4 是根據 (-) strain 設計的
為了確定可以把 eGFP 去掉，
除了一定要的 Cas9 以外，
打算做
gRNA1+
gRNA2
gRNA1+
gRNA4
gRNA3+
gRNA2
gRNA3+
gRNA4 四組 co-transfection
然後再看看哪一組都不亮了、並配合 FACS 跟 genomic DNA PCR 確定真的成功了。
設計這四組 co-transfection，合理嗎?
還是我們想太多了?
雖然很可能試了才知道怎麼會成功，
不知道有沒有人可以分享一些經驗^^
謝謝 m(_ _)m
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 73.164.8.164
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1421992061.A.AFA.html
1F：→ williamyang: 我的做法是先確認單獨的會切,再做送一對的 01/23 14:01
2F：→ williamyang: 至少目前都沒失敗過 01/23 14:01
3F：→ williamyang: 還有你的cell line要選合適的,HeLa不是適合的 01/23 14:02
4F：→ silverberry: 單獨的會切，也是送 cell 裡嗎? 這樣要怎麼確認有切? 01/23 14:37
5F：→ silverberry: 目前是做 CHO cell，之後可能會做 hES or mES 01/23 14:38
7F：推 williamyang: knockout and knockin都是working的 01/23 14:44
8F：→ silverberry: 請問是多大的 knockin? 我希望未來可以把 GFP 01/24 10:49
9F：→ silverberry: 放到 target gene 的後面做 reporter 01/24 10:50
10F：→ silverberry: 還是我先 knockin loxp 之類的序列 比較適合? 01/24 10:50