大家好~ 目前我的實驗是重組E.coli的特定蛋白， 做修改及探討。 使用的KIT是 http://www.genebridges.com/products/quick-easy-e-coli-gene-deletion-kit 在之前送進了會產生重組蛋白的質體， 也做過特異性比對， 原本的菌株是沒有抗AMP抗性的， 問題在於送進第二段的PCR產物後， 幾乎完全沒有clone的產生。 我所使用的是根據KIT上建議的primer設計， 是在真正參與PCR作用的20個bp的primer上在增加50bp去做兩端辨識交換的位置， 所以會產生約70bp的primer， 而所使用的template是根據KIT給予的plasmid， 所使用的是ACCU DNA polymerase， 10X Buffer 5ul 最終1X 10mM dNTP 0.5ul 最終0.1mM Primer 各1ul 最終0.2uM template 1ul (KIT表示濃度50ng/ul) ACCUpolymerase 0.5ul 滅菌過 二次水 補足50ul 也有試過KOD-PLUS-， 10X buffer 5ul 1X 2mM dNTP 5ul 0.2mM 25mM Mg2SO4 2ul 1.0mM primer 各1.5ul 0.3uM template 1ul (KIT表示濃度50ng/ul) KOD -plus 1ul 滅菌過 二次水 補足50ul PCR條件為 95度 5分鐘 ----- 95度 30秒 60度 30秒 70度 2分鐘 ----- 以上30 cycle 70度 10分鐘 4度保持 問題在於出來的濃度都不高 電泳跑膠後， 根據mark似乎是正確的位置， 只是在0.5K以下的位置有一團模糊的團塊， 也有以KIT做完切膠純化後， 以電穿孔方式送入。 發現可供挑選的clone比預期少很多。 篩選用抗體是kanamycin 15ug/ml， 挑選完後， 抽完DNA後已PCR方式去分析發現， band依舊並無改變， 目前似乎最大的問題是在PCR的產物上有無正確的產生我要的產物。 請問 我該如何以plasmid為模板正確的設計出我要的PCR產物? 還有哪些條件需要設計或改變的? 感謝 --

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