目的是為了替除掉特定的目標蛋白。 使用的菌種是E. coli K-12 所使用的KIT是Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit http://www.genebridges.com/products/quick-easy-e-coli-gene-deletion-kit 基本上我都按照上面的protocol去做， 前面送重組質體的部分， 已經很順利地送了進去， 也有作對照的部分， 原本的菌種是沒有抗amp抗性的表現， 培養時溫度也都控制在30度， 也有拿溫度計做校正。 主要是在第二次電穿孔時， 送進去PCR好的片段進入， 這個片段有先跑膠，並切膠純化出來。 使用的純化KIT是 GeneMark的DNA Clean/Extraction KIT 也全部都按照此上面建議使用， Elution solution也是使用KIT所附上的。 測量OD260時， 因為濃度過低， 添加的體積約為3~6ul的使用。 電穿孔也是按照原本protocol所述1350V， 但是因為我們的機器沒有辦法調整ms的時間， 有時會到10ms， 主要是做了數次後， 再塗盤後， 還是都沒有clone的產生。 請問， 會是我的primer設計有錯誤? 還是我的PCR條件有問題? 我的PCR是使用ACCU DNA POLYMERASE， 也有請教過有含有高保真性質的能力。 條件是 一開始 5分鐘 95度， 接下來30cycle 95度30秒 60度30秒 70度2分鐘 之後 70度7分鐘 跑膠後， 在大約1.5K之上有一條BAND產生， 但是在低於0.5K之下有一團模糊的團塊。 我有針對這個部分做了切膠。 只是之後濃度頗低， 所以添加的體積略高於原廠的建議值1~2ul。 想請問使否會有所影響? PCR的條件要在改變? 還是我原本的primer設計失敗? 辨識位置的50bp過短? 請問我這樣還有哪裡要改善的或是有重大問題? 或是請教大家有無好的濃縮片段方式? 感謝大家了~~ --

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