作者gto33456789 (太人生了)
看板Biotech
標題[求救] 蛋白質表現出來做成抗體染IHC的問題
時間Thu Dec 11 15:29:32 2014
大家好
最近收到之前 把表現出來的蛋白質給抗體公司 做成的抗體
拿來試染
我用的是Biogenex的系統 用DAB呈色
先拿PCR陰性的片子來試染
把原液稀釋5000X 10000X 25000X 50000X來試染
看背景有沒有上
想不到染出來,整片有組織的地方都上了..又稠又濃
根本無法辨認
請問我下一步 該怎麼trouble shooting..
因為失敗所以還有一個疑問:
我自己生產出來的一抗, 可以接上comerical kit的二抗嗎
謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.96.58
※ 文章網址: http://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1418282975.A.9E7.html
1F：→ blence: 有做過用lysate與其他如WB測試效力或專一性嗎？ 12/11 20:11
2F：推 blence: 這樣問是無助於解決IHC問題,但應該沒算超出你的問題範圍 12/11 20:21
3F：推 caesar0926: 同一樓 先做wb至少看一下會有幾條band 12/11 22:01
4F：→ caesar0926: 自己產的抗體物種對 買來的二抗是可以認的到的 12/11 22:03
5F：→ caesar0926: 還有DAB呈色時間要抓一下 有時會太強 12/11 22:05
6F：→ caesar0926: 另外想到你有用3% H2O2 這個步驟嗎? 12/11 22:06
7F：→ caesar0926: 上面%數不確定(更正一下 12/11 22:06
8F：→ Ianthegood: 二抗前wash久一點... 可以洗到兩三天 12/11 23:11
9F：→ jabari: 1.先作western 2.你的蛋白如何表現純化 可以說明一下嗎@@? 12/12 18:04
10F：→ jabari: 我前lab有人請公司作一抗 然後丟給他們SDS-PAGE切下來的膠 12/12 18:05
11F：→ jabari: 搞了很久才知道原來是彼此都沒純化XD~ 重用一批就好多了 12/12 18:06
12F：→ skyken10: 如果以上方法都無法解決問題，可以試著用你原本的抗原 12/12 20:27
13F：→ skyken10: 對抗體進行純化。因為IHC的抗原都是folding完整的，應 12/12 20:27
14F：→ skyken10: 該會與你純化的抗原非常相似，所以經過的純化的抗體會 12/12 20:27
15F：→ skyken10: 比較好使用！ 12/12 20:27
16F：推 abcam: 可考慮用DAKO的 二抗……我認為 好用 。背景值又乾淨。大 12/12 22:03
17F：→ abcam: 推……現在的代理商 比之前的代理商 便宜 超多的！又專業:- 12/12 22:04
18F：推 jabari: 保吉@@? abcam自家沒有推薦貨嗎?? XD~ 12/12 22:05
19F：→ gto33456789: 有用lysate做WB, 都OK 12/13 04:03
20F：→ gto33456789: DAB我可以試試時間少一點 謝謝, 有H2O2這步驟 12/13 04:03
21F：→ gto33456789: PAGE的產物是通管柱, histag來抓的純化產物 12/13 04:05
22F：→ gto33456789: 現在只有第六針的sample,之後全採血才會抗體純化 12/13 04:06
23F：→ gto33456789: 我用DAKO的二抗沒錯, 蟹蟹大家 我繼續找問題 12/13 04:06
24F：→ gto33456789: 純化是E.coli的系統 12/13 04:09
25F：→ gto33456789: 更正: 表現是用E.coli的系統 12/13 04:09