※ 引述《aaaazzzz (找英文家教)》之銘言： : 標題: [求救] 請教transfection失敗的原因 : 時間: Tue Dec 2 15:19:59 2014 : : 請教各位先進， : 我想要knockdown Axl(屬於一種receptor tyrosine kinase)， : 使用plasmid pLKO.1與Polyjet(一種reagent)， : 實驗分成control(不處理), scramble control(空的vector), knockdown : 結果相較於control，scramble control與knockdown這兩組的Axl(target gene)都有 : 下降(但我預期看到的是僅僅knockdown這組有下降) : 想請問可能的原因有哪些？ : : PS: : (1)scramble control學理上要放non-target sequence，但實驗室沒有這種control : (2)先前實驗室有做過GFP測試是OK的，約在transfection 24小時候收細胞 : (3)transfection時間的排程:如今天下午五點transfect(plasmid與polyjet in : serum-free medium, 然後放入有serum的medium 1cc)，明天下午早上八點換medium， : 後天早上八點收細胞，通常都會看到有transfect的組別細胞會死3-5成 因為推文的方式有點亂，所以我重打了一些內容， (半年前才開始使用pippe，很多實驗細節不同請見諒) 我想請教的，還包含時間與細胞量對transfection的重要性， (1)transfection後的時間是否應該拉長?(目前我是在transfection之後15小時換新的 medium,再隔24小時收細胞，是否應要拉長至48或72小時效果會較好？但我control(沒有 transfections)的那一組細胞會爆量，還是說control的細胞種少一些，scramble 與knockdown組別的細胞種多一些？) (2)或者是transfection時的細胞較少會容易成功?(目前我開始transfection時細胞約9 成滿,剛好鋪一層,我在想transfection成功後的細胞複製時也會被knockdown,這樣說 是不是一開始的細胞不要太多，但protocol是說細胞約9成5的時候開始transfection) (3)或者是說transfection只會影響當時的細胞？(如果不影響子代，那應該一開始種細胞 越多越好，然後在transfection隔15小時左右直接收細胞，不需像我目前是隔15小時 換medium，又多等24小時才收細胞) (4)Transfection應該要影響RNA或者是RNA,protein都要影響？(我覺得應該要影響RNA 跟protein，但我的結果對RNA沒有knockdown的效果(RT-PCR, 電泳, Image J定量), 只對protein(western)有影響(scramble, knockdown組都影響了，下降量約1/3) (5)關於transfection(knockdown, overexpression)，有沒有些知識可從網路上 找到相關參考資料？ : : : -- :

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 210.60.122.151 : ※ 文章網址: http://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1417504802.A.8A0.html : 推 Elvis76: 我建議你降低polyjet 的量再做一次看看，有時候過多的rea 12/02 22:18 : → Elvis76: gent 會影響細胞的基因表現。 12/02 22:18 : → aaaazzzz: 您的建議聽起來合理,一般建議polyjet:DNA around 3:1 12/02 22:28 : → aaaazzzz: 慮您的建議，謝謝！ 12/02 22:30 : → aaaazzzz: 本實驗室先前測試4:2效果最好(是前輩,不是我)，我會考 12/02 22:32 : → blence: "做過GFP測試是OK?" 是指一般cds vector而不是shRNA吧？ 12/02 23:49 : → blence: shRNA都偏大,如果用一般GFP測試OK,應該只能說polyjet可用 12/02 23:51 : → blence: 要反映出4:2的比例最好,可能很沒說服力 12/02 23:52 : → blence: 尤其GFP又只做24小時,這應該只看有表現而不是表現比例吧? 12/02 23:53 : → blence: 我用幾家不同的經驗都顯示plasmid越大,對應reagent該越多 12/02 23:56 : → blence: 以上不見得解決眼前問題,只是覺得既有的測試設計並不適當 12/03 00:05 : → aaaazzzz: 所以請問B大對我的實驗,vector就造成target gene表現下 12/03 00:39 : → aaaazzzz: 降,有沒有具體的測試方法或可能原因，謝謝！ 12/03 00:40 : 推 scherzoinb: 不負責任的建議︰做不同時間點收細胞來看表現量 12/03 16:45 請教不同時間點的意思？是要延長post-transection的時間嗎？ 這樣的間隔差不多要幾小時才適當？ : → scherzoinb: 也許你就會知道什麼時間收細胞會比較好 12/03 16:47 : → scherzoinb: 還有表現量下降，是用Q-PCR測的嗎？差很多嗎？ 12/03 16:50 : 推 scherzoinb: scramble、knockdown的下降量會差很多嗎？ 12/03 16:56 : → aaaazzzz: 表現量是從protein來看,scramble與knockdown相較於contr 12/04 13:44 : → aaaazzzz: ol約下降1/3,但knockdown與scramble兩者差不多 12/04 13:48 : → aaaazzzz: 如果用RT-PCR加上跑電泳與Image J定量,control,scramble 12/04 13:49 : → aaaazzzz: knockdown三者差不多 12/04 13:50 : → blence: 順便在問一個無助解決的你推文疑問的,你已經確定shRNA可用 12/04 18:40 : → blence: 了嗎？ 通常這類實驗不work,transfection並不是優先煩惱的 12/04 18:41 先前實驗室都說可以knockdown(最近做的學姊約在一年前實驗，兩個月前 離開本實驗室囉，目前僅把plasmid重測濃度，沒繼續做GFP，說實話，我目前也不會做 GFP測試，想趕時間，所以都相信實驗室的東西是OK的) : 推 Realthugz: housekeeping gene結果正常嗎? Housekeeping gene一致 : 推 scherzoinb: 默默地推bl大，如果是我的話，我會另外做幾組把抗生素 12/05 14:17 : → scherzoinb: 的量，加到2倍、3倍等，然後你要想你要做的是 12/05 14:20 : → scherzoinb: transient transfection或stable transfection？ 12/05 14:22 我要做的是transient transfection，S大您提到的抗生素， 是指製作的plasmid沒有達到knockdown的效果嗎？ (抱歉,沒做過plasmid合成實驗,剛接觸實驗沒多久,不是很清楚您的意思) : → scherzoinb: 再去看一下抗體認的位置是在knockdown序列之前， 12/05 14:23 : → scherzoinb: 還是在knockdown序列之後？scramble多放幾天看表現量 抗體辨認的位置會有影響嗎？knockdown不是整個表現就會下降？ 所以是說當初primer設計的位置可能有問題？ : → scherzoinb: 會不會變得跟normal差不多？ 所以您的意思是延長post-transfection的時間,我的scramble有可能跟control會一致？ : → scherzoinb: 還有就是RT PCR的primer，要跨過knockdown的序列， 12/05 14:28 : → scherzoinb: 這樣你才會知道knockdown有沒有效果， 12/05 14:29 這是考量到primer設計嗎？ : 推 scherzoinb: 從你RT PCR的結果，很難推定你的knockdown是有效的~~~ 12/05 14:36 --

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