作者aaaazzzz (找英文家教)
看板Biotech
標題[求救] 請教transfection失敗的原因
時間Tue Dec 2 15:19:59 2014
請教各位先進，
我想要knockdown Axl(屬於一種receptor tyrosine kinase)，
使用plasmid pLKO.1與Polyjet(一種reagent)，
實驗分成control(不處理), scramble control(空的vector), knockdown
結果相較於control，scramble control與knockdown這兩組的Axl(target gene)都有
下降(但我預期看到的是僅僅knockdown這組有下降)
想請問可能的原因有哪些？
PS:
(1)scramble control學理上要放non-target sequence，但實驗室沒有這種control
(2)先前實驗室有做過GFP測試是OK的，約在transfection 24小時候收細胞
(3)transfection時間的排程:如今天下午五點transfect(plasmid與polyjet in
serum-free medium, 然後放入有serum的medium 1cc)，明天下午早上八點換medium，
後天早上八點收細胞，通常都會看到有transfect的組別細胞會死3-5成
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1F：推 Elvis76: 我建議你降低polyjet 的量再做一次看看，有時候過多的rea 12/02 22:18
2F：→ Elvis76: gent 會影響細胞的基因表現。 12/02 22:18
3F：→ aaaazzzz: 您的建議聽起來合理,一般建議polyjet:DNA around 3:1 12/02 22:28
4F：→ aaaazzzz: 慮您的建議，謝謝！ 12/02 22:30
5F：→ aaaazzzz: 本實驗室先前測試4:2效果最好(是前輩,不是我)，我會考 12/02 22:32
6F：→ blence: "做過GFP測試是OK?" 是指一般cds vector而不是shRNA吧？ 12/02 23:49
7F：→ blence: shRNA都偏大,如果用一般GFP測試OK,應該只能說polyjet可用 12/02 23:51
8F：→ blence: 要反映出4:2的比例最好,可能很沒說服力 12/02 23:52
9F：→ blence: 尤其GFP又只做24小時,這應該只看有表現而不是表現比例吧? 12/02 23:53
10F：→ blence: 我用幾家不同的經驗都顯示plasmid越大,對應reagent該越多 12/02 23:56
11F：→ blence: 以上不見得解決眼前問題,只是覺得既有的測試設計並不適當 12/03 00:05
12F：→ aaaazzzz: 所以請問B大對我的實驗,vector就造成target gene表現下 12/03 00:39
13F：→ aaaazzzz: 降,有沒有具體的測試方法或可能原因，謝謝！ 12/03 00:40
14F：推 scherzoinb: 不負責任的建議︰做不同時間點收細胞來看表現量 12/03 16:45
15F：→ scherzoinb: 也許你就會知道什麼時間收細胞會比較好 12/03 16:47
16F：→ scherzoinb: 還有表現量下降，是用Q-PCR測的嗎？差很多嗎？ 12/03 16:50
17F：推 scherzoinb: scramble、knockdown的下降量會差很多嗎？ 12/03 16:56
18F：→ aaaazzzz: 表現量是從protein來看,scramble與knockdown相較於contr 12/04 13:44
19F：→ aaaazzzz: ol約下降1/3,但knockdown與scramble兩者差不多 12/04 13:48
20F：→ aaaazzzz: 如果用RT-PCR加上跑電泳與Image J定量,control,scramble 12/04 13:49
21F：→ aaaazzzz: knockdown三者差不多 12/04 13:50
22F：→ blence: 順便在問一個無助解決的你推文疑問的,你已經確定shRNA可用 12/04 18:40
23F：→ blence: 了嗎？ 通常這類實驗不work,transfection並不是優先煩惱的 12/04 18:41
24F：推 Realthugz: housekeeping gene結果正常嗎? 12/05 03:00
25F：推 scherzoinb: 默默地推bl大，如果是我的話，我會另外做幾組把抗生素 12/05 14:17
26F：→ scherzoinb: 的量，加到2倍、3倍等，然後你要想你要做的是 12/05 14:20
27F：→ scherzoinb: transient transfection或stable transfection？ 12/05 14:22
28F：→ scherzoinb: 再去看一下抗體認的位置是在knockdown序列之前， 12/05 14:23
29F：→ scherzoinb: 還是在knockdown序列之後？scramble多放幾天看表現量 12/05 14:25
30F：→ scherzoinb: 會不會變得跟normal差不多？ 12/05 14:26
31F：→ scherzoinb: 還有就是RT PCR的primer，要跨過knockdown的序列， 12/05 14:28
32F：→ scherzoinb: 這樣你才會知道knockdown有沒有效果， 12/05 14:29
33F：推 scherzoinb: 從你RT PCR的結果，很難推定你的knockdown是有效的~~~ 12/05 14:36