作者shunminhsu (sharkhsu)
看板Biotech
標題[求救] 如何讓酵素SanDI(KflI)失活!!??
時間Sun Nov 23 08:08:15 2014
由於實驗上的需求，所以要用到SanDI及另外一種酵素(非快切)去切質體。但SanDI
剩快切有貨，和老師商量後下訂。但在最近要使用時才發現這隻酵素無法熱失活，
說明書上面是建議用phenol/chloroform extraction..不過實驗室裡面並沒有這些
藥品，所以想請問各位前輩，是否有其他的辦法使其失活呢?
現在有考慮過使用plasimd的kit純化，但不曉得可不可行..老師也不太確定 囧
深怕SanDI沒弄乾淨的話，第二支酵素會切不了阿..
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1F：推 skybreeze: kit 應該是不會保留protein,但也只能試試看 11/23 09:11
2F：推 Ianthegood: 直接做double digest? 11/23 12:38
3F：→ nawussica: phenol chloroform 好取得 看這萃取法會不會做而已 11/23 12:44
是的..現在就是擔心對這手法不熟悉，畢竟後面還要再切第二刀。怕第一次弄完，整個濃
度會掉光..不夠切第二刀.
4F：推 leptoneta: 苯酚和氯仿今天訂明天就來了 也不貴 11/23 14:06
5F：→ blence: 前面就問過了,既然SanDI都買FD的,另一個也有FD版可用阿 11/23 14:14
6F：→ blence: 至於要不要HI取決你下一步要做什麼,如果是要跑膠,根本不用 11/23 14:17
感謝blence大熱心回答，但這兩支酵素似乎沒辦法一起double digest.. 至於切完的話，
是要做ligation用的..
7F：→ turtle24: 我這邊跑環安流程訂氯仿用了一個月唷XDD 11/23 15:26
8F：推 huuban: phenol/chloroform小量的話直接去找別間實驗室要比較快 11/23 16:33
9F：→ huuban: 但是超過一定量帶離實驗室一樣要過環安衛 11/23 16:34
※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.149), 11/23/2014 17:11:03
10F：→ blence: 如果只是ligation,HI需要煩惱嗎？ 11/23 17:21
11F：→ blence: 你要問非雙切的步驟?還是如何失活? 看起來就不是後者阿 11/23 17:23
呃..說明書就寫:Optional: Inactivate the enzyme by phenol/chloroform extraction
現在問題卡在不曉得這個步驟是不是必要的..怕酵素如果真的沒失活或拿掉的話會有影響.
因為處理雙切完的plasmid還要用ExoIII下去做反應...
※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.149), 11/23/2014 18:36:18
12F：推 Ianthegood: 如果bfr condition是ㄧ高一低的話 可以試試先做低的 11/23 21:14
13F：→ Ianthegood: 反應完直接補鹽做高的 11/23 21:15
感謝good大的建議..但一個是快切buffer 另一個是普通buffer 這樣可行嗎!?
酵素好貴阿..不太敢亂浪費XD
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 11/24/2014 09:04:45
14F：→ cillion: PCR clean up kit 11/24 21:32
OK 我會試試看的! 只是比較不懂的是.. 其他快切酵素的說明書幾乎都有用kit的步驟，
唯獨這支酵素都沒寫，搞得我好亂阿 冏
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 11/25/2014 08:41:26
15F：推 jimmy80727: 大不了切一刀跑膠回收再切第二刀 12/02 02:33
16F：→ travelmat: clean kit or gel extration 12/14 15:22