作者waitingu (Phil-Ku)
看板Biotech
標題[討論] in vitro system與細胞實驗 藥物劑量差異
時間Tue Nov 11 17:50:13 2014
由於最近在補一個藥物實驗的data
看到in vitro kinase assay覺得滿好玩的
就來嘗試看看 結果卻令人有點無法解釋:
Compound A在kinase assay可以拉出正常的inhibitor log曲線 換算回去IC50為17 uM
但在細胞實驗中 只要2 uM的compound A
即可對此kinase p-Tyr level及其下游蛋白磷酸化有很顯著的抑制效果
(IP及WB已重複多次)
令我疑惑的是 通常都是細胞實驗或動物實驗的劑量
會大於IC50 of kinase activity劑量 (這還滿好解釋的 像是half-life等等)
但現在情況卻反過來 原廠是建議可以調整ATP濃度看看 能不能把log曲線往左右移動
(已經試過調整kinase量，對求得的IC50沒有顯著差異)
跑去問藥理跟藥學的同學 她們說還滿常碰到這種情形的
也只能把這個data收起來或再repeat看看
想請問一下各位專家們，碰到這種情況該怎麼解釋
或是有可以改變的條件讓兩種實驗的濃度不要差太多呢?
感謝！
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1F：→ yuasa: Kinase assay的原理是什麼呢?Sensitivity說不定比較差 11/11 22:01
2F：→ yuasa: 也有可能是像原廠說的condition沒有抓得很好 11/11 22:01
我是用Progema的ADP-Glo system
簡易版步驟就是:
kinase + inhibitor + ATP反應
然後再加入ADP-Glo這個reagent去反應
最後加入reaction buffer去測冷光
所以可調整的變因大概都在第一個反應那邊
3F：→ yuasa: 也有可能compound A不太專一，在細胞內有別的效果出現 11/11 22:02
4F：→ EDaDaDaDaDa: 有沒有可能是進入細胞內compound A的量比出細胞的少 11/11 23:12
5F：→ EDaDaDaDaDa: 導致胞內外濃度差，所以實際胞內濃度已經遠超過2uM 11/11 23:12
這解釋也是有可能 但又要想實驗證明(默
6F：推 qiet: 未必是direct target 到那個kinase上, 也可能透過indirect 11/11 23:48
7F：→ qiet: 作用, 如影響更上游 or 加強phoshatase功能等等 11/11 23:48
8F：→ qiet: in vitro 做出來IC50是17uM應該沒有人會相信是真的on target 11/11 23:49
沒錯 這也是我覺得很恐怖的原因
9F：推 Ianthegood: data永遠是對的(默) 11/12 00:06
10F：→ blence: 其實整篇看不懂原廠指的是哪一個,compound? kinase? kit? 11/12 00:48
11F：→ blence: 文中提到原廠建議調整ATP,你卻調整kinase,好像雞同鴨講 11/12 00:50
我第一次實驗先做了ATP conversion standard curve & 原廠建議的kinase量
發現偏高以後 將kinase量減半 其他條件相同 再做一次實驗 發現結果差不多
才致電原廠 並得到可以從ATP量下手的建議 XD
※ 編輯: waitingu (140.122.143.252), 11/12/2014 09:51:55