作者kevinjeng (Mr.Kai)
看板Biotech
標題[求救] Plasmid跑電泳稀釋後位置亂跑??
時間Wed Nov 5 14:52:33 2014
小弟本身主要是做病毒研究，最近在進行clone，抽出plasmid、用enzyme digestion切一
刀把circular form plasmid切成linear form後跑電泳check有沒有被酵素切到
原本因為沒有切的plasmid是用midi kit抽，所以濃度很高，跑電泳時常變成很亮的一坨，
所以最近有做20X稀釋後才放下去跑
結果發生奇妙的狀況:
沒有稀釋的plasmid位置大致上正確(約11k)，但是20X稀釋的plasmid位置比起沒稀釋的竟
然高了一大截，而且幾個sample(相同clone的plasmid)狀況都一模一樣!
除此之外，enzyme digestion product 也很明顯沒有切到(band的位置低於原本plasmid，
當然也低於20X稀釋的原plasmid，
酵素換過全新的，狀況相同，所以懷疑是plasmid出了問題
enzyme切位在我的plasmid上確定只有一個在poly-A tail上
因為以往做類似clone(plasmid大小相同、切位相同、酵素相同)沒有這種情形，不知有沒
有大神可以幫助我一下?原本認為這樣一個enzyme digestion是再簡單不過的事情，出這
種包讓我現在有點不敢面對老闆與學長姐們......
謝謝大家~~~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.116.63.54
※ 文章網址: http://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1415170355.A.DBE.html
1F：推 KittyGod: 你敘述的稀釋跟沒有稀釋plasmid有沒有酵素切阿 11/05 15:21
稀釋跟沒有稀釋的都沒有切，我主要是要看這個酵素有沒有切到，把原本沒切的plasmid做稀釋是想看哪個condition跑電泳看起來比較好看
2F：→ KittyGod: 用酵素切也要約略抓一下plasmid濃度 11/05 15:22
3F：推 Bows: supercoil form? 我之前是沒稀釋位置不對，稀釋後位置才對 11/05 15:24
4F：→ Bows: 是看看切一刀之後再跑大小看看 11/05 15:24
切一刀後，位置反而跑比較下面，就我所知跟我以前的狀況都是切完變成linear form後應該要跑得比較慢，這次看起來都比較快......
※ 編輯: kevinjeng (140.116.63.54), 11/05/2014 15:32:54
5F：→ turtle24: 定量一下 有切沒切DNA放相同ng跑看看 11/05 18:59
6F：→ milkpa: coil-linear-supercoil 看看到底是那個form 11/05 22:26
7F：推 jabari: 超螺旋族 跟 反螺旋族..... 建議買個螺旋族marker 11/05 23:13
8F：→ blence: 我的經驗是10k以下,一般vector,切完位置大都往上跳 11/06 00:42
9F：→ blence: 但是lenti等viral vetor,或一些1Xk以上的plasmid,常猜不準 11/06 00:44