作者stone1105 (ㄝ..)
看板Biotech
標題[求救] western blot 糊掉
時間Mon Oct 6 13:07:01 2014
各位大家好
目前我的western blot遇到了一些問題
想請大家幫麻找出問題點
這是我的圖
http://imgur.com/HyQ71yL
以下是我的實驗步驟
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在跑膠時，我是用10%的膠
上膠是60V~80V
下膠是80V~120V
transfer是100V 60~90min結束
blocking是用5%牛奶 室溫一小時以上
一抗1:10000 4度C O/N
TBST buffer(0.2% tween20) wash
二抗1:10000 室溫一小時
TBST buffer(0.2% tween20) wash
加入 millipore ECL
然後用UVP照膠系統去分析
結果如上面。
我有換過
1.配膠的buffer
2.transfer buffer
可是問題還是一樣
所以目前是猜測transfer的電泳槽哪裡有問題
另如濾紙、海綿、卡夾、電泳槽本身
過去2年來濾紙一直都有回收重複使用都沒問題
但現在甚至只回收一次也會這樣
是哪裡還有問題嗎?
煩請各位幫忙解惑
謝謝
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1F：推 martyrtitan: Buffer過熱 10/06 13:08
2F：→ stone1105: 我是在4度C transfer，60min後都還冷冷地。不過下次會 10/06 13:18
3F：→ stone1105: 再注意看看 10/06 13:19
4F：推 nymph: transfer沒綁緊? 兩邊緊了但中間沒貼緊? 10/06 13:28
5F：→ biingru: transfer中間沒有貼緊 有時候版子用久了會有弧度 10/06 14:11
7F：推 jack33: ransfer中間沒有貼緊? 或是剛好有氣泡沒注意到? 10/06 20:27
8F：推 alaric: 先確定PAGE有沒有跑好. 每個wells可能要用buffer沖一沖. 10/06 20:54
9F：推 ko363630: transfer的問題 10/06 23:12
10F：推 im9527tw: 海綿沒有平整?我之前出現這樣發現是海綿沒有平 10/06 23:58
11F：推 Ianthegood: transfer完可以用ponceau S染看看 10/07 12:58
12F：→ supray: 用的membrance需要先泡methanol處理嗎? 沒泡完全? 10/09 09:48
13F：推 Realthugz: 看似transfer以前的問題 鑄膠玻璃和齒梳有對嗎 10/11 03:39
14F：→ Realthugz: 也有可能是氣泡 10/11 03:40
15F：推 spirithorse: transfer沒夾緊+1, 3M paper前後各放兩張吧!!(過來人 10/13 00:48
16F：推 mrbeachfan: 去隔壁借別家的transfer用用看吧... 10/19 05:53
17F：→ stone1105: 謝謝樓上的各位，後來換了卡夾跟海綿就沒有問題了。 01/12 12:44
18F：→ stone1105: 如果有人有這種問題，可以參考看看!!! 01/12 12:44