作者hsinhsien (HH)
看板Biotech
標題[求救] western blot 一片空白
時間Thu Sep 25 16:40:03 2014
各位前輩大家好
我是實驗室新手上路
有個問題想問大家
目標是要偵測分子量約78的蛋白
condition如下：
以50-80V runing
以300mA transfer
5%脫脂牛奶 blocking
一抗 1:500 ；GAPDH 1:1000 overnight
PBS wash三次 每次10分鐘
二抗1:5000 40分鐘
ECL壓片 1、3、5分鐘
問題是壓出來的片子 一 片 空 白
感覺就像是不曾壓過片直接沖片一般
我transfer完後有用ponceau S呈色看一下
明明就都有看到band
一抗和二抗也確定都沒加錯 也都是新鮮配的
請大家救救我 我已經壓兩次了 都是一片空白
感謝大家幫我回答問題
我是連GAPDH都沒壓出來
其實我上星期有壓出來一次
但這週要repeat data確一直沒出來
原本以為是二抗重覆使用的問題
但我今天重配了 確還是一片空白
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.142.73.83
※ 文章網址: http://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1411634405.A.AE6.html
1F：→ Bows: 1.你可以問實驗室學長姊 2.ECL有不同偵測極限09/25 16:46
2F：→ Bows: 3. 我們壓片時間是不固定的，沒Band最高加到10min這樣09/25 16:47
3F：→ Bows: 5.ECL可能有問題09/25 16:48
大家都用同一罐ECL 所以應該沒問題
4F：→ Bows: 4. protein 下的量也會有差09/25 16:49
可是我這次laod 10ul 上次laod 5ul確有出來
5F：→ honey823: 二抗種類有用對嗎？若沒問題可能是二抗壞了？09/25 17:02
二抗用對 有其他人也有用過
6F：推 Ianthegood: 還是就是沒有這個protein09/25 17:10
7F：→ Ianthegood: 有壓positive嗎?09/25 17:10
8F：推 tsubasawolfy: GAPDH也沒有？09/25 18:03
就是連GAPDH都沒有才怪啊!
※ 編輯: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:07:32
※ 編輯: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:08:21
※ 編輯: hsinhsien (223.142.73.83), 09/25/2014 22:09:53
9F：推 tsubasawolfy: 跟別人借底片壓壓看 kerker 09/25 22:26
10F：→ tsubasawolfy: 讓我想到有人把底片拿出來數剩幾張的笑話 09/25 22:26
11F：推 greenwind: 洗片機藥水剩太少？ 09/25 22:51
12F：推 ko363630: 不是抗體壞了 就是ecl壞了 09/25 23:31
13F：→ Ianthegood: 顯影劑定影劑底片 一個一個debug 09/26 01:24
14F：→ blence: 挑剔一下原文沒提到2抗是否一樣,有沒wash,上次GADPH強度? 09/26 02:09
15F：→ blence: 因為是新手,我會猜是前(幾)次78kda看太弱,不斷加強各濃度 09/26 02:12
16F：→ blence: 之後,GADPH訊號太強早早就燒掉,所以整個反白了 09/26 02:14
17F：推 kakaman: 洗片機換個藥劑看看 09/26 02:28
18F：推 Choco1107: 用CCD測啊，看學校可否更新設備 09/27 15:12
19F：推 dennisyoung7: 燒掉的話membrane上面也可以看到燒焦 09/30 15:04
20F：推 eyest: 二抗時間拉長試試看呢 10/02 23:11
21F：推 charliedorae: CCD 10/06 11:50
22F：推 stone1105: 感覺燒掉+1 10/07 14:16
23F：推 machin: 二抗壞掉?lab其他人有無類似問題嘛? 10/07 18:12
24F：推 mrbeachfan: 換別的ecl試試看! 前幾個禮拜才發生!Q 10/19 05:57