作者shunminhsu (sharkhsu)
看板Biotech
標題[求救] PCR跑不出來!! 請各位前輩幫忙..
時間Thu Sep 11 16:28:40 2014
既上次抽染色體的問題解決之後，現在又遇到PCR的問題。
之前抽出的E.coli K12 測nanodrop濃度約:350ng/μL
260/280:2.04 ； 260/230: 1.88
配方如下:
10x buffer:10μL dNTP:10μL primer(50μM):各1μL
KOD:2μL MgSO4:6μL template:3μL DI水:67μL
PCR condition:
95度C 120sec --->denature
55~65度C 60sec---> annealing
72度C 60 sec ---->extension
30 cycle
配成100μL分成10管測溫度gradient，但每次跑膠完幾乎都沒東西。
和老師討論完的結果，可能是template的量太多。於是又改成1μL去跑，
但跑出來也是全部空的..所以想請問各位前輩問題可能出在哪裡!?
去查DNA template的使用濃度說法也都不同..
現在也滿擔心本身template或primer本身出問題..
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※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:29:29
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:40:47
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:45:21
1F：→ a90648: dNTP濃度多少?之前發生過有人忘記dilute所以跑不出來 09/11 16:50
dNTP:2mM
2F：→ blence: 既然用了KOD，為什麼PCR condition不是照KOD的建議？ 09/11 18:09
呃..實驗室學長也是用差不多的條件，所以就沒再調整了
3F：→ ko363630: template濃度是um還是nm？ 09/11 20:59
當時測出來的時候是350 ng/uL ..
※ 編輯: shunminhsu (114.35.165.133), 09/11/2014 22:18:11
※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/11/2014 22:21:02
4F：推 leoblack: 建議你用KOD建議的條件做~太濃的template KOD反而沒產物 09/11 22:32
5F：推 ko363630: 同樓上 原ＰＯ真的太濃了 09/12 10:07
6F：→ Ianthegood: template用10% 09/12 10:24
7F：→ Ianthegood: 然後為什麼不把條件列成濃度還要我們幫你算= = 09/12 10:25
因為我不太懂濃度的單位... 去參考每個人的都不同= =
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 10:37:39
8F：→ blence: 各種PCR條件的濃度單位幾乎都一樣,只有數值的不同 09/12 10:45
9F：→ blence: 如果各家都不同,何不直接參照KOD就好,整篇都沒寫單位很扯 09/12 10:4
不好意思，這部分我會再注意..
[1;31m→
supray: 單位要弄清楚呀... 09/12 11:49
supray: amplicon多大呢? 09/12 12:33
要P的產物大概950bp，照理不難P才對 冏
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 13:41:50
10F：推 leoblack: KOD建議plasmid的template濃度只要1ng就好~你下了多少？ 09/12 13:42
11F：→ leoblack: genomicDNA只要200ng就好 09/12 13:43
呃... 最後一次dna template是加1μL .. 溶液總量100μL
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:09:16
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:10:10
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:17:03
12F：推 ararthur: 只能建議盡量用"重量"或"濃度"去算 少用體積才不會失了 09/12 15:43
13F：→ ararthur: 重點 09/12 15:43
15F：→ supray: 是上面那組嗎? 09/12 17:37
16F：→ supray: 說明都寫得很清楚 也有Troubleshooting呀 09/12 17:39
17F：→ Ianthegood: 不管怎麼樣換成濃度都比體積好 09/14 17:11
18F：→ freiburg: volume is nothing!! 09/15 04:32
19F：推 a102242002: 我的經驗是這樣，使用多個濃度的DNA去做PCR,看哪個濃 09/22 17:32
20F：→ a102242002: 度有做出來就使用那個濃度 09/22 17:32
21F：→ satasumi: 1.建議重測濃度 2.起始denature溫度跟時間? 09/29 00:16