作者silverberry (平行線上的交集....)
看板Biotech
標題[求救] Lentivirus titer 測定
時間Sat Jul 19 15:38:51 2014
大家好，我是 lentivirus 的新手，
想請問版上操作 lentivirus infection 的版大們，
有無推薦的 kit 或是方法測定 lentivirus 的 titer?
在網路上查到很多家不同的 ELISA p24 antigen kit 和不用抽 RNA 可以快速做 qPCR
LTR region 的 kit。
或是用 GFP 類的 reporter 測定 transduction efficiency
也查到 paper 比較分別測定 DNA、RNA 和 protein 量來估計 titer 的方法 (ref. 1)
選擇太多了，不知道哪一個比較適合。
挑幾種買來試試看這種想法應該會直接被碾出實驗室 Orz
我是在化工系的實驗室，
實驗室之前的助理是用體積記錄感染的用量，
結果推算出了轉染率 <0.001% 的實驗記錄。
雖然我看了版上之前的討論文，了解 lentivirus packaging 和 vector size 成反比。
但是用體積來計算實在讓人很崩潰啊 @ @
和指導教授討論以後希望可以精確地用 MOI 之類的數量化方式來繼續這個實驗。
所以想知道大家平常都是怎麼數量化這個步驟的。
謝謝大家。
ref. 1
http://www.nature.com/gt/journal/v9/n17/full/3301731a.html
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我們用的 lentivirus vector 是 addgene 的
FUW-OSKM 和 pLOVE 系列，
用 psPAX2 + pMD2.G 在 HEK293FT cell 用 lipo2000 packaging.
Packaging 完收的 medium 用 Amicon 100kD 濃縮後，分裝保存在 -80.
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 75.72.204.238
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※ 編輯: silverberry (75.72.204.238), 07/19/2014 15:41:33
1F：→ shelix:SBI有QPCR KIT...可是夭壽貴 07/19 18:08
2F：→ soom:lab之前是eGFP virus感染293t，推測該批病毒的活性 07/20 01:09
3F：→ soom:不過這種做法當然耗時，也只敢相信10的幾次方這樣的scale 07/20 01:11
4F：→ soom:好處是能知道"活病毒"的量，而不是死活都一起測 07/20 01:13
5F：推 roy047:類似二樓 取少量virus感染少量cell看GFP，也有lab是跑qPCR 07/20 06:21
6F：→ silverberry:感謝樓上，所以如果 vector 沒有 GFP 就要自己做一個 07/21 00:54
7F：→ silverberry:來當 titer 測定的依據的意思? 07/21 00:55
8F：→ silverberry:感謝大家的建議 07/21 00:55
9F：推 liuse:你的vector有帶任何antibiotics嘛? 07/21 04:56
10F：→ liuse:有的話 用96-well plate seed series cell density 07/21 04:56
11F：→ liuse:橫向加四種不同的virus量，感染後加藥，讓沒infect的細胞死 07/21 04:58
12F：→ liuse:亡，之後數每個well剩多少細胞，劃出curve就可以算出titer了 07/21 04:59
13F：→ liuse:不過對不同種類的細胞會不一樣就是 07/21 05:00
14F：→ roy047:如果原本沒GFP加了GFP表現量會不一樣 所以也不需要硬加 07/21 07:10
15F：→ roy047:可以改用別的方法測 除非以後實驗全都換成有GFP的 07/21 07:11
16F：推 heparinase:既然要用MOI, 我會用flow cytometry分析GFP細胞比例， 07/23 08:03
17F：→ heparinase:換算titer 07/23 08:03
18F：→ silverberry:謝謝大家的建議。比較完 Kit 和 ELISA 以後，發現 07/25 12:08
19F：→ silverberry:價格都不太和藹可親。GFP 的部分要跟其他同學討論一下 07/25 12:09
20F：→ silverberry:目前可能會先參考 paper 設計 LTR 的 primer 做 07/25 12:09
21F：→ silverberry:minus strong-stop cDNA 的 qPCR。 07/25 12:12
22F：→ silverberry:先用 viral genome 濃度做參考~ 07/25 12:12