作者lidon00968 (滿滿的希望!!)
看板Biotech
標題[求救] 關於SDS-PAGE
時間Mon Jun 9 13:43:53 2014
如題，最近實驗室跑SDS-PAGE出現重大的問題
附上圖片
http://ppt.cc/nd-s
http://ppt.cc/Y0yS
這個是跑完退染之後的照片，不知道為什麼在100kDa的附近會有一條不明條帶
通過該條條帶的band就會像圖片上所顯示變得歪七扭八
我們家使用的SDS-PAGE 上層膠5%，下層膠是10%
使用的電壓為100V、120min
機器上顯示的電流大約為20~40mA之間
也有試過定在15mA下去跑，狀況依舊
使用的PH值為6.8和8.8，藥品都是最近新鮮配製的，
不管是Tris-base(HCl調製到所選PH值)，還是電泳的buffer
APS也是新鮮配製，TEMED是新分裝出來的，實驗室都放在4度C冰箱保存
Acrylamide我家使用的好像比較特別，是30%的那一種
不過也跟別人家的實驗室借過40%的來使用，情況還是一樣
sample buffer也是最近才配置，含有2-ME的那種版本
我已經抓問題抓到不知道還有甚麼東西出問題會造成這樣的現象!
上圖都是使用的ATTO的系統所跑出來的膠圖
附上使用Bio-Rad跑的膠圖
http://ppt.cc/3BP4
使用的蛋白來源是組織經由超音波震盪萃取出來
濃度大約為30ug左右吧(沒有經過確實定量因為是測試所以就隨意抓一下!
這現象最近一個月才出現，完全不知道是為什麼?
想請問版上的各位，有人遇過和我一樣的情況嗎?有甚麼解決辦法!
還是有甚麼東西是我沒有注意到的，謝謝大家!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.130.98.85
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※ 編輯: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 13:51:15
1F：推 laurel007:推測是配下膠時沒壓好 06/09 15:20
2F：→ laurel007:不然就是stacking時用更小的電壓去跑,用60~80V 06/09 15:22
3F：→ hodala09:將pH6.8的buffer，通過0.22um過濾後再使用。 06/09 15:44
關於過濾一點，我會立刻嘗試看看，非常感謝!
補上綠色箭頭以上代表就是上層膠體的部分，這幾次我都有特地保留上層膠染色
http://ppt.cc/8sto
做下層膠做完的時候我都是用70%酒精下去壓
倒掉酒精的時候可以看出下層膠很平，也看不到那條詭異的線
但是跑完膠之後其實隱約就可以到到那條怪怪的東西跑出來，染完色更明顯就是!
※ 編輯: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 16:02:00
4F：→ blence:在marker那條,第1,2次有出現,第3次沒有,是補PSB的差異？ 06/09 17:15
5F：→ lidon00968:請問PSB是甚麼東西? 是系統不同 分別是ATTO和Bio-Rad 06/09 17:47
6F：→ lidon00968:我家sample的處理都是樣品+水+sample buffer 06/09 17:48
7F：→ lidon00968:不過蛋白萃取的方式是取0.5mg組織+500ul PBS進行超音波 06/09 17:48
8F：→ lidon00968:樣品配好後會100度煮10分鐘 然後才進行跑膠 06/09 17:53
※ 編輯: lidon00968 (140.130.98.85), 06/09/2014 21:54:00
9F：→ jsi:有個疑問pH6.8的buffer，通過0.22um過濾後pH值不會上升嗎? 06/09 23:36
10F：→ lidon00968:好奇為什麼會上升? 理論是?? 今天我又再配製一次藥品 06/09 23:45
11F：→ lidon00968:明天再來測試看看狀況是否有改善! 06/09 23:45
12F：→ blence:protein sample buffer;你的marker那條,只有第三次沒出現 06/10 00:04
13F：→ blence:請從PSB確認最後濃度至少有1X,以及8.8與6.8是從Tris base配 06/10 00:33
14F：→ blence:起,至於6.8先過濾或調降電壓,除非你們只想先看到data,不然 06/10 00:34
15F：→ blence:這兩種不是一般實驗室操作必要的條件,顯然也不會是問題所在 06/10 00:36
非常感謝，今天已經全部再重新配製所有會用到的藥品
從tris-8.8和6.8、sample buffer、running buffer都重新配置
6.8和8.8也都有作過濾的動作，明天會再試試看是否有改善
再次謝謝大家!
※ 編輯: lidon00968 (36.237.212.42), 06/10/2014 01:00:29
16F：推 leptoneta:感覺是下膠還沒完全凝固就加上膠 06/10 11:53
17F：→ lidon00968:我很確定我下膠凝固後，才吸掉酒精，確定是平的 06/10 19:09
18F：→ lidon00968:才加入上層膠溶液做上層膠 06/10 19:09
19F：推 IDIDyan:感覺是下膠濃度不均勻，前兩張圖都有一半的lane跑得頗歪 06/10 20:16
20F：→ IDIDyan:做膠時混勻後再加，另外也有可能是機器老舊而電流過高 06/10 20:17
21F：→ IDIDyan:試著條低電壓跑或在低溫跑看看 06/10 20:18
22F：→ lidon00968:了解，非常感謝!! 如果要換機器，老闆可能會崩潰XD 06/10 20:49
23F：→ IceDR:你有沒有重配10% SDS? 06/11 06:03
24F：→ IceDR:或是RUNNING BUFFER的SDS濃度太低 之前實驗室發生過類似情況 06/11 06:05
禮拜一重新配製藥品後，總算恢復正常!
非常感謝版友們的協助!!
推測應該是那罐快10年SDS壞了，所有會使用到SDS的溶液全部都使用新的SDS配製
現在都很正常!
附上一張現在的膠圖
http://ppt.cc/2A-2
非常感謝大家!
※ 編輯: lidon00968 (140.130.98.85), 06/11/2014 13:14:14
25F：推 puec2:哇，SDS會壞喔，這真的沒遇過。 06/12 15:31
26F：→ puec2:上了一課。 06/12 15:31
27F：→ hodala09:而且是在第十年才壞，前9年還是好的？ 06/13 22:09
28F：→ lidon00968:不知道.. 東西全部都測試過了 直到換了SDS才好 06/19 16:22
29F：→ IceDR:我在不同實驗室遇過兩次這種怪膠 都是RUNNING BUFFER出事 08/02 02:54
30F：→ IceDR:一次是有配RUNNING BUFFER STOCK沒加10% SDS 08/02 02:55
31F：→ IceDR:然後對稀釋完的RUNNING BUFFER補對應的10%SDS就OK 08/02 02:56
32F：→ IceDR:第二次是有人稀釋STOCK手殘忘了加STOCK 我要求重配也沒人信 08/02 02:57
33F：→ IceDR:然後有問題的RUNNING BUFFER一用完 稀釋新的一瓶就回復正常 08/02 02:58