作者IDIDyan (我)
看板Biotech
標題[求救] 如何確認長片段tandem repeat的數目
時間Mon May 26 23:47:34 2014
最近碰到的棘手問題懇請各位幫忙~~
目標是 MUC4，這個 gene的 exon 2 主要是由連續的tandem repeat(48bp/TR)組成
之前文獻指出每個人的這段序列長度相差很大 (7k~19k都有)
我想知道的是""我們的病人和其他正常人的這段TR數目是否有差別""
由於檢體量不多沒辦法做southern blot
之前嘗試用Long PCR的方式把整段TR P出來，可惜沒有band
PCR condition 如下
TaKaRa LA Taq (5 units/μl) 0.5 μl
10X LA PCR Buffer ll (Mg2+free) 5 μl
25 mM MgCl2 (final 2.5 mM) 5 μl
dNTP Mixture (final 400 μM each) 8 μl
Template 500 ng
Primer 1 1.0 μM (final conc.)
Primer 2 1.0 μM (final conc.)
ddH2O to 50 μl
92°C 2 min
↓
92°C 10 sec------
55°C 30 sec 10 cycles
68°C 15 min------
↓
98°C 10 sec---------------------
55°C 30 sec 20 cycles
68°C 15 min + 15 sec/cycle------
↓
68°C 7 min
不知道能怎麼調整，或是有其他方法確認TR數目
請大家幫幫忙!拜託了!!
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1F：推 ljii:P不出來的是病人sample嗎? 有沒有試過用最短的repeat數 05/28 13:46
2F：→ ljii:當positive control, 至少確定primer可用? 05/28 13:47
3F：→ ljii:另外, tandem repeat的PCR本來就很困難, 有時連短短1kb都很難 05/28 13:47
4F：→ ljii:P, 何況你這是long PCR. 有沒有可能不要用long PCR硬幹? 05/28 13:48
5F：→ ljii:例如digest後跑膠看size? 檢體量不足不能作western但夠digest 05/28 13:50
6F：→ ljii:嗎? 05/28 13:50
7F：→ IDIDyan:我現在是先用正常人和cell line的sample先試 05/28 14:05
8F：→ IDIDyan:由於無法確定每個人的repeat次數所以也不知道誰最短... 05/28 14:05
9F：→ IDIDyan:請問lj大先切看size的意思是什麼呢?我有試過用RE先把其他 05/28 14:07
10F：→ IDIDyan:可能的nonspecific target切掉再PCR可惜還是沒有 05/28 14:08
11F：→ IDIDyan:我也想知道有沒有其他步要用硬幹的方式哈哈.... 05/28 14:08
12F：→ Ianthegood:用phusion看看 05/28 16:03
13F：→ IDIDyan:之前有問過phusion polymerase，最多能做到16k，可是文獻 05/28 16:15
14F：→ IDIDyan:上寫這範圍可能有7k~20k... 05/28 16:15
15F：推 jabari:南方點墨法QwQ 我家某TRmut小鼠這樣genotype 05/28 16:16
16F：→ IDIDyan:檢體DNA沒那麼多啊ˊˋ 05/28 16:36
17F：推 ljii:我有點誤解你的意思了, 你的sample是genomic DNA, 所以我的 05/30 06:21
18F：→ ljii:結論是最好的選擇是作southern. 你的probe可以選擇去anneal 05/30 06:22
19F：→ ljii:那段repeat, 因為你的repeat很多, 所以signal會超級亮. 所以 05/30 06:22
20F：→ ljii:你需要的genomic DNA量就不用那麼大, 1ug應該就夠了, 甚至更 05/30 06:23
21F：→ ljii:少都可能可以. 這跟detect single copy gene的southern動輒 05/30 06:23
22F：→ ljii:要好幾十ug的genomic DNA是不一樣的. 05/30 06:23
23F：→ ljii:另外Phusion對long PCR我覺得並不太優, 最強大的還是takara 05/30 06:24
24F：→ ljii:LA, 但是takara的proofreading感覺上沒有phusion佳.不過你沒 05/30 06:25
25F：→ ljii:差, 不需要非high fidelity不可. 05/30 06:25
26F：推 ljii:另外文獻裡有人有long PCR的protocol嗎? 還是你是自己設計 05/30 06:28
27F：→ ljii:primer在抓條件? 05/30 06:29
28F：推 jabari:同意ljii...TR用傳統南方是可行的..只是要買大膠台XD 05/30 13:39
29F：→ jabari:BTW 我家小鼠取尾巴gDNA...量其實很少 但也可以作 05/30 13:40
30F：推 jabari:或是原PO試試用random primer跑Long PCR再作南方試試..說 05/30 13:42
31F：→ jabari:不定是可行的方法??(累一點而已) 05/30 13:42
32F：→ IDIDyan:這麼想想似乎southern真的可行，感謝兩位! 05/30 14:54
33F：→ IDIDyan:另外Long PCR 我是參考各廠商的condition自己調整的 05/30 14:55
34F：推 ljii:嗯, 如果用廠商給的protocol, 遇到tandem repeat PCR, 往往 05/31 14:20
35F：→ ljii:就會遇到地雷. 我舉自身實例, 我研究的是某個triple nucleoti 05/31 14:21
36F：→ ljii:nucleotide repeat 疾病. 我們研究的這個病, 如果要PCR包含 05/31 14:22
37F：→ ljii:那段repeat的區域, 傳統Taq是死都p不出來的,即使片段只有1kb 05/31 14:23
38F：→ ljii:這個field用來PCR這段就是有固定的primer及polymerase, 大家 05/31 14:24
39F：→ ljii:都只用那幾種.改用別家的polymerase幾乎不可能work 05/31 14:25
40F：→ IDIDyan:我看到前人對我這段repeat都是做southern 05/31 23:04
41F：→ IDIDyan:所以PCR condition只能自己試 qq 05/31 23:04