作者dirkwen (kevin)
看板Biotech
標題[求救] qRT-PCR基因表現問題
時間Thu May 22 10:13:21 2014
各位版友
小弟我是用qRT-PCR作相對定量的基因表現
做了A、B、C三個targeted gnen與用18s rRNA作Internal control。
以下有幾個問題
(1)因為老師只希望每個基因作一重複
所以有先請我挑選五個不同的SAMPLE作二重複在不同天做
然後要去看批間與批內的變異情形(inter-assay and intra-assay variability)
想請問我要怎樣算才是比較正確的?以個人看?還是以基因看?
http://ppt.cc/VRE8
http://ppt.cc/62Pc
綠色的部分為每個基因所有SAMPLE二重複的MEAN SD CV
紅色的部分為每個SMAPLE二重複的MEAN SD CV
最後橘底的為那一盤上所有基因每個SAMPLE的MEAN SD CV
不太知道哪個是對的?還是全錯了...?
(2)因為是做相對定量要用2^-△△Ct作分析
但是我的實驗只有一個時間點且都是CASE沒有CONTROL
只能算出各個SAMPLE的每個基因的△Ct(A、B、C基因CT-18S CT)
沒有一個原始點可以算△△Ct，所以我之後可以直接用每個基因△Ct直接做分析嗎?
還是也可以用2^-△△Ct作分析△△Ct這部分就帶入△Ct那樣?
麻煩有經驗的大大解惑了! 謝謝!!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.4.211
※ 文章網址: http://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1400724804.A.B5E.html
1F：推 as862437:想問一下(1)批間的話是同樣的DNA在不同天跑嗎? 還是說實 05/25 00:46
2F：→ as862437:驗的天數不同? 批內的話是要比表達量吧! 05/25 00:47
3F：推 as862437:如果是要比較A.B.C 基因在五個 sample 中的表達，把兩次 05/25 00:53
4F：→ as862437:當成biological repeat的話 就是紅色那個 05/25 00:54
5F：→ as862437:綠色的話是在比較 基因ABC之間的相關性 05/25 00:54
6F：→ dirkwen:謝謝A大解說，批間是指同樣cDNA不同天跑 05/26 23:36
7F：→ dirkwen:老師當時還有請我算每個人不同天各基因四個點算MEAN&SD 05/26 23:38
8F：→ dirkwen:之後算出一個CV，然後看一看說好，我不太了解 05/26 23:39
9F：→ dirkwen:那是要看這個人在這個基因做不同天共兩次兩重複的變異嗎? 05/26 23:40
10F：→ as862437:就我的理解，你的不同天只是操作上的變異跟生物性質無關 05/27 14:00
11F：→ as862437:所以我會解讀成同樣的sample (人) A.B.C基因 做4重複(2*2 05/27 14:01
12F：→ as862437:不同天用來檢測你的數據穩定度 05/27 14:02
13F：→ dirkwen:謝謝A大的解說，有比較了解了:) 06/02 23:40