作者gugu283 (gugu283)
看板Biotech
標題[求救] phalloidin staining
時間Sat Apr 26 00:30:11 2014
請問有關phalloidin的螢光染色實驗~
我想觀察F-actin的polymerization
使用Acti-stain 488的phalloidin 細胞為MDA-MB-231
製作sample過程如下:
3.7%formaldehyde fix 10 min
warm PBS wash
0.5% triton 5min
PBS wash
100 nM phalloidin 30min
PBS wash X3
100 nM DAPI 1min
wash
seal
但是在螢光顯微鏡下觀察
細胞形狀都爛爛的 很多毛邊 甚至呈萎縮狀
沒辦法看到一束一束的F-actin 而是整顆細胞都綠色的 而且細胞內感覺染到很多顆粒
請問有什麼方法可以改善細胞形狀的問題?
整顆細胞的綠色是可能為non-specific binding嗎?
(我已試過phalloidin內加1% BSA，或染之前先以1% BSA bloking 30min )
感激不盡!!
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1F：→ snow200272:FA也要warm!!! or try methanol fix 04/26 00:40
2F：推 tchan:triton X-100 只要0.1%就夠了 & DAPI看起來如何？有可能不是 04/26 11:14
3F：→ tchan:染色過程出問題，而是細胞本身狀態就不好 04/26 11:14
4F：→ gugu283:DAPI染起來OK, 我會試試看warm FA, 但是methanol似乎會破 04/26 13:11
5F：→ gugu283:壞actin?那我triton 也改成0.1%試試看；細胞本身是還好雖 04/26 13:13
6F：→ gugu283:然沒有很漂亮 但我固定完跟triton處理完在顯微鏡看 都沒有 04/26 13:14
7F：→ gugu283:像染完以後萎縮得那麼厲害 毛邊也沒有那麼多@@ 04/26 13:15
8F：→ gugu283:我用90%甘油封片會有影響嗎? 04/26 15:15
9F：→ snow200272:如果DAPI沒問題~應該就是DAPI以前步驟的關係 04/27 20:59
10F：推 oplz:不要亂教.. phalloidin 不會認 methanol fixed actin fiber 04/28 06:59
11F：→ oplz:PFA or FA 溫的冷的都沒差 04/28 07:00
12F：→ captdavince:請問有人有經驗應該cold去固定還是warm固定比較好呢? 04/28 19:22
13F：→ gugu283:請問有人用過這隻phalloidin嗎?不知道有沒有人試過濃度? 04/30 11:34
14F：→ gugu283:我有試過更高濃度但還是整顆細胞都綠色，看不太到fiber 04/30 11:36
15F：→ gugu283:我也試過染時放37度C 但還是整棵綠 小妹都要崩潰了T^T 04/30 11:38
16F：推 tchan:哪隻pholloidin?? 我常用的是invitrogen的A12379 05/01 17:37
17F：→ tchan:跟你的步驟差不太多，只是pholloidin染色時放37度C 05/01 17:38
18F：→ tchan:然後依照細胞不同調整所需pholloidin的量，選一個最好的 05/01 17:38
19F：→ tchan:我是用warm&fresh prepared 4 %PFA。Triton 則是用0.1% 05/01 17:40
20F：→ tchan:之前我用0.5%的trixton時也印象中是整顆綠，沒有fiber 05/01 17:41
21F：推 jabari:會是PBS/PBS"T"的問題嗎? tween20可以維持triton開的孔洞 05/01 18:21
22F：→ snow200272:不知道跟cell type有沒有關係~有沒有其他細胞可以當con 05/02 12:48
23F：→ snow200272:tol呢 05/02 12:48
24F：→ gugu283:我調整了之後還是染不太到fiber欸...而且細胞形狀一直很爛 05/03 21:22
25F：→ gugu283:FA和PFA固定有差嗎?還是不是專門用來培養細胞的玻片會有差 05/03 22:11
26F：→ gugu283:我是沒有看過有人用PBST耶@@ 05/03 22:11
27F：→ gugu283:我用的是cytoskeleton的Acti-stain 488 拜託高手解救T^T 05/03 22:12
28F：→ tchan:data sheet用的細胞是3T3，看看是否要拿來當control 05/04 01:13
29F：→ tchan:或者我本身經驗是WI-38以及A549都可以非常容易染到Fiber 05/04 01:14
30F：→ tchan:找些positive control確認你的所有材料都沒問題吧!! 05/04 01:14
31F：推 frank22004:我們全都在室溫下 05/25 13:11
32F：→ yinshuang:你的phalloidin接的是綠色螢光，細胞當然是綠色的.... 07/21 16:03
33F：→ yinshuang:降低phalloidin的濃度或wash久一點，應該會出現你要的。 07/21 16:05