作者zodiac123 (鳥松吳尊)
看板Biotech
標題[求救] PCR產物與primer設計
時間Wed Apr 23 13:06:13 2014
大家好
事情是這樣的
原先有一條cDNA序列(RACE做出的) 而且有一組primer 跑PCR可以夾出一段序列(約120bp)
但用該組primer跑PCR卻夾不出gonome DNA (怎麼跑band都在100bp以下....超煩)
我也試過以不同annealing溫度夾出120bp片段 但不是雜band一堆 就是只夾出100bp以下
的片段
所以我又另外以cDNA序列設計一組primer 位置大概是原先primer兩邊擴展30-40bp的地方
想說先以該段primer夾出一段序列(約220bp) 在稀釋PCR產物(100倍) 再以巢氏PCR原先的
primer夾出目標序列(120bp) 剛剛試了不同annealing (分別為48,50,52,54,56,58)且使
用後來設計的primer夾出220bp 卻又夾不到目標序列(220bp)
想請問大大有沒有其他方法可以改善QQ 不懂我到底出了什麼問題?
或許一開始夾出120bp的primer的condition可以改善QQ
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※ 編輯: zodiac123 (140.112.80.2), 04/23/2014 13:08:44
1F：→ vandia:我有沒有看錯?@@ 你要拿夾cDNA的primer去夾genoimc DNA??? 04/23 13:09
2F：→ vandia:你是認真在問的嗎?? 04/23 13:11
3F：→ WinnieDad:intron可能很大一條或N條，或者是你cDNA的primer剛好卡 04/23 13:45
4F：→ WinnieDad:在intron-exon的boundary都可能P不出來。 04/23 13:45
5F：推 hajimels:你cDNA primer要挾gDNA，除非一開始你就設計在exon上 04/23 15:26
6F：→ vandia:用cDNA的primer去夾gDNA,不可能P出你要的120跟220吧.. 04/23 21:27
7F：→ vandia:你說後來設計的夾到220有送定序確認是你要的嗎? 04/23 21:27
8F：→ zodiac123:cDNA沒有intron 所以primer會設計在exon上 04/23 23:05
9F：→ zodiac123:每次p出來都只有小於120bp的band 照理講應該要等於或者 04/23 23:06
10F：→ zodiac123:大於 有可能primer卡在 intron-exon的地方 感謝大大QQ 04/23 23:06
11F：→ zodiac123:To V大 因為band的bp數都是小於原先預設的 所以沒送 04/23 23:08
12F：→ zodiac123:照理講應該要大於或等於阿~~~~好苦惱 04/23 23:09
13F：→ blence:你是真的講cDNA沒有intron？還是要講primer沒有跨intron？ 04/23 23:34
14F：推 mesenchymal:本文跟推文一起看看不懂,所以你primer設計到底有沒有 04/24 01:47
15F：→ mesenchymal:跨intron? 04/24 01:47
16F：→ xxtomnyxx:小於 100 bp 我認為是 primer dimer 比較有可能 04/24 08:54
17F：→ zodiac123:不太知道有沒有跨到intron... 04/24 09:40