作者bear2926 (大能)
看板Biotech
標題[求救]蛋白質定量
時間Wed Apr 2 15:18:07 2014
請問大家，我最近在跑ＷＥＳＴＥＲＮ．
可是每次定量都不一致
使用ＢＳＡ去求Ｒ平方,以及BIO-RAD-PROTEIN蛋白試劑
配成400ul
總total取100ul放到96-well上去測ELISA
蛋白sample則取2ul和試劑398去混勻
也是取100ul
定量出來後去跑western，
每次的control和DMSO的表現量都會比其他下藥的蛋白還要多
是使用coomassie blue去染色一小時而知道結果
每次定量完後，假如我要取２０ｕｇ的蛋白，每次都得取不一樣量的ｕｌ數
取量甚至差距到一半
求解？是因為定量出問題 還是蛋白本身ＤＭＳＯ和ｃｏｎｔｒｏｌ就會表現比較多！？
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1F：→ Invec:利用96孔盤作蛋白質定量請參考台大bct第四章4.2節 04/02 18:16
2F：→ Invec:加入呈色劑後若時間拉的太長或間隔不一會造成定量誤差 04/02 18:17
3F：→ bear2926:謝謝你喔 04/02 21:37
4F：推 dehydrogenas:擬定量的方法有問題 04/07 13:41
5F：→ bear2926:請問怡嚇是我的步驟有問題還是手有問題，謝謝你喔 04/07 21:41
6F：推 qiet:有點看不懂... 不過如果你的實驗組加的藥會讓細胞死亡 04/07 23:33
7F：→ qiet:蛋白質濃度相對於control/DMSO組別低是正常現象 04/07 23:33
8F：→ qiet:因為細胞加了要長的就比較少&比較不健康要死不活 04/07 23:34
9F：→ qiet: 藥 04/07 23:34
10F：→ qiet:但定量要是準的話, 同樣取20ug蛋白下去染色應該不會差太多 04/07 23:35
11F：→ qiet:除非細胞真的死的太慘, 04/07 23:35
12F：→ qiet:另外在配置跑膠的mixture時，取control由於濃度較加藥組濃 04/07 23:36
13F：→ qiet:要避免pipet時carryover的現象，會造成濃度配出來不準確 04/07 23:38
14F：→ bear2926:謝謝，我養的是ｃｏｌｏ２０１，加藥下去確實會使細胞死 04/08 10:01
15F：→ bear2926:我在收蛋白的時候 也有發現細胞飄起來很多 04/08 10:02
16F：→ bear2926:我也有把飄起來的細胞一起收蛋白 04/08 10:03
17F：推 dehydrogenas:步驟有問題 你可以寫一下你用的dye名稱嗎 04/08 12:02
18F：→ bear2926:4X protein loudong dye 波仕特公司的 04/09 09:01
19F：→ dehydrogenas:你自己寫的是Bio-Rad 然後又說是波仕特? 04/09 15:43
20F：→ dehydrogenas:BTW 是protein loading dye吧 XD 04/09 15:44
21F：→ bear2926:HAHA，BIO-RAD是定量時用的試劑。 04/10 15:45
22F：→ bear2926:波仕特是４Ｘ loading dye沒錯 一時打太快 哈哈哈 04/10 15:46
23F：推 allisa:細胞死太多也會影響到cytoskeleton 04/30 13:18