作者lacampanella (Concerto No.2)
看板Biotech
標題[求救] Western blot的protein似乎卡在well
時間Sun Mar 30 23:03:24 2014
目前正在用SDS-PAGE嘗試壓185kD左右的蛋白質，
試過很多次，但每一次的結果都是在250kD以上有很淡且形狀不規則的band，
而且可以另外看到很深色的band緊鄰於well下方。淡band離深色band有一段距離。
然而其他比較小的protein（140以下）情況正常。
抗體的專一性、marker的正確性應該是沒問題，
所以這樣的情況我懷疑是protein aggregate，或是有multiprotein complex卡在gel下
不去，我查到網路上有些人建議不要煮，會使protein aggregate，但是有人卻說煮也
沒關係；有人是說煮完要再離心一次，只取上清（但是這樣濃度不就變了@@）；有人建
議用DTT；總之，眾說紛紜……
不知道各位知不知道什麼方法可以改善這種情況？
謝謝。
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Protocol如下：
1. 1XRIPA（含proteinase inhibitor）萃取protein：組織搗碎之後sonicate（也試過
不sonicate），4度C離心15min，取上清液，測濃度，加入1XRIPA與sample bfr（含
2-ME）配好每一管sample（80-100ug/well）
2. 100度C水煮5min，on ice 2min
3. load in 7%（也試過8%）的gel，60V 30min，然後轉90V 1hr30min
4. Transfer（濕式） 75V 4hr到PVDF membrane上
5. Blocking 2hr in 5% TBST-milk 室溫
6. 1Ab 1:1000 overnight 4度C
7. TBST wash 10min X3
8. 2Ab 1:1000 1hr 室溫
9. TBST wash 5min X4
10. TBS wash 5min X2
11. ECL呈色
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※ 編輯: lacampanella (61.230.126.111), 03/30/2014 23:05:01
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※ 編輯: lacampanella (61.230.126.111), 03/30/2014 23:14:51
1F：推 qiet:80-100ug/well, 濃度有需要這麼高嗎, 會不會都卡住了啊 03/30 23:16
2F：→ qiet:5-20ug/well應該可以應付大部分的狀況, 除非量真的很少 03/30 23:18
3F：→ lacampanella:意思是說濃度太高會卡住？ 03/30 23:30
4F：推 joseph103331:我跑過一個350k的 加bete-mercap就一定壓不到 03/31 01:16
那你是用DTT？
5F：→ blence:你跑膠的時間太短dyefront應該才2/3處吧？ 03/31 05:59
已經跑到gel的邊緣了
6F：→ blence:至於你的濃度? 你用BCA測嗎？? 03/31 06:00
是
※ 編輯: lacampanella (61.230.126.111), 03/31/2014 08:04:32
7F：推 alaric:用rainbow marker, 確定你要的區域有分開, 還要多跑些 03/31 15:48
8F：推 jabari:好吧....你sonicate的probe有磨平嗎??? 03/31 18:32