作者USARMY (戰鬥小雞)
看板Biotech
標題[求救] q-PCR每一批control的GAPDH量不一樣
時間Fri Mar 28 22:28:05 2014
各位大大好
我q-PCR跑出來的GAPDH每一批sample的contrl組所測出來的值都不一樣(ex:28,18,31)
但是實驗室的人卻沒有這種問題, 他們說每一批的control組測的值都差不多。
有想過可能是轉cDNA的過程出錯,但是我一次都是轉很多批,
所以那次轉的那幾批應該也要差不多才對,可是卻沒有。
定量的機器是Maestrogen nano drop, PCR機器是ROCHE的light cycle 480。
請問有可能是那些地方會影響到GAPDH的差別?
感謝
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1F：推 mesenchymal:1. 只用GAPDH當internal control不一定足夠,有時 03/28 22:52
2F：→ mesenchymal:GAPDH表現量仍可被影響,建議再找1個2個其他genes輔助 03/28 22:53
3F：→ mesenchymal:2. 照你寫的Ct值(28, 31)似乎遠低我印象中GAPDH的ct值 03/28 22:54
4F：→ mesenchymal:不知道你拿多少RNA轉cDNA,又拿多少template跑qPCR 03/28 22:55
5F：→ mesenchymal:你似乎要確定你RT有轉成功 03/28 22:56
6F：→ mesenchymal:3. nano drop也只是用OD260來測量RNA conc.相對準但 03/28 22:58
7F：→ mesenchymal:不是絕對,不知道你的260/280還有260/230值多少? 03/28 22:59
8F：推 bluesnow1122:cybr green有混均勻嗎?(認真) 03/28 22:59
9F：推 mesenchymal:至於其他操作問題,我就不提了,請其他高手補充 03/28 23:01
10F：推 jabari:加一個PTC calibator... 作△△CT 讓沒次跑的數據跟PTC比Ra 03/29 07:03
11F：→ jabari:tio, 這樣就算ref有變動也不會影響實驗數據. 用LC480的話 03/29 07:03
12F：→ jabari:直接派就行了 03/29 07:03
13F：→ jabari:記得Calibator最後會設為0..用advance relative 改linear 03/29 07:06
14F：→ jabari:顯示 我想你的數據就ok了 03/29 07:06
15F：→ allthebest:多加1-2house keeping gene+1 03/29 13:44
16F：推 allthebest:RNA quality 除了看260280值也可以跑一下膠check 03/29 13:48
17F：→ USARMY:感謝各位指導,internal control會再找找看其他的,因為有關 03/29 16:58
18F：→ USARMY:細胞體積,所以才沒用actin等。cybr green是有mix均勻的,因 03/29 16:59
19F：→ USARMY:為我每次跑的同一批GAPDH都會一樣,所以我猜測是轉cDNA時的 03/29 17:00
20F：→ USARMY:問題。j大的方法我會再研究一下,感謝唷! 03/29 17:02
21F：→ USARMY:感謝a大的建議 03/29 17:12