作者bluesnow1122 (藍雪)
看板Biotech
標題[求救] 切位是正確的但是切不下來
時間Thu Mar 27 11:24:06 2014
我設計基因左右兩邊不同的切位(XbaI/KpnI)的primer(有多加4個mer)
PCR之後加A,ligation到pGEMt-easy
之後抽plasmid送定序,序列是對的,切位都在
切EcoRI OK
跑基因全長的PCR OK
跑M13F+M13R OK
唯獨切XbaI和KpnI切不下來...
XbaI和KpnI確定沒有問題
我用同樣的條件切另一個clone的基因是可以切下來的
我是先切XbaI 1HR 再切 KpnI-HF 30 mins (NEB)
想請問有沒有什麼問題是我沒有考慮到的? 謝謝~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.117.93.237
※ 文章網址: http://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1395890649.A.F0D.html
1F：→ grox:methylation? CpG? 還是你要切久(O/N)看看? 03/27 11:54
2F：→ soom:XbaI 是dam methylation sensitive 03/27 11:55
謝謝提點
我的切位序列是
5' 3'
GA
T|CTAGACC
CT
AGATC|TGG
3' 5'
網路上找到的資料是 XbaI前後有GATC就會受甲基化影響
請問甲基化的問題有辦法解決嗎?
或是換限制性切位會比較快? 謝謝
※ 編輯: bluesnow1122 來自: 140.117.93.237 (03/27 12:37)
3F：推 soom:找dam-的菌株(ex. JM110) 或是設計別的切位都可 03/27 12:51
4F：→ bluesnow1122:謝謝^^ 03/27 13:41
5F：→ roy047:樓上正解~ 沒dam就不會甲基化了 plasmid seq不受影響 03/27 13:41