不好意思 有個問題想請教一下各位 我最近在用DCFH-DA來偵測光動力治療在細胞內產生的ROS 實驗是使用搭載亞甲基藍的奈米粒子 在先前的實驗中已經證實過在溶液裡經過雷射刺激後會產生ROS了 DCFH-DA是跟sigma買的 買回來之後是先在酒精裡面配成10 mM溶液 再用PBS稀釋10倍成1 mM stock solution 平常是冰在-20度C冰箱裡避光保存 實驗protocol如下: 1.Hela cell seeding density: 5000#/well in 96 well plate Culture medium: DMEM high glucose w/ 10% FBS and 1% PSA 2.After 1 day of incubation, these cells were incubated with mixed solution of culture medium (w/o FBS) and DCFH-DA stock solution at a ratio of 100:1 for 30 min in incubator 3.PBS washed x3 to remove excess DCFH-DA. 4.加入搭載亞甲基藍的奈米粒子培養2hr 5.把奈米粒子移除掉之後，每格加入少許PBS以防止well完全乾掉 6.以660nm雷射照射4分鐘激發亞甲基藍以產生ROS 7.用螢光顯微鏡觀察 我在進行到第三步的時候發現細胞幾乎全部都被洗掉了 一開始以為是洗3次太多 我就改成只洗一次 沒想到還是掉光了 硬著頭皮做下去 那些極少數還沒掉的細胞的螢光強度也是非常非常低 實驗組與控制組之間幾乎沒有差異 在進行實驗之前我都有先用顯微鏡觀察過Hela cell 貼附情形都還蠻不錯的 所以應該不是細胞健康狀況的問題 我稍微查過一些文章發現有人DCFH-DA是配在DMSO裡面 第二步那邊有人是用PBS來稀釋 請問會是這些原因嗎? 我們LAB裡面沒有人做過 只好上來求救了 感謝各位 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 112.104.64.239