作者ayenyayaya (ayenya)
看板Biotech
標題[求救] DNA 純化問題 (DNA extraction kit)
時間Thu Mar 13 14:03:54 2014
目前我正進行cloning
將某PCR片段塞進某plasmid
目前遇到的問題是
我把 1 ug plsmaid用restriction enzyme (總體積10 ul) 切過之後
將之進行純化
利用Geneaid Gel/PCR DNA Fragmants Extraction Kit
1. 首先與DF buffer 混合
2. 再過 DF column 離心 6000g 30s
3. 用75%EtOH wash buffer清洗 離心 6000g 30s
4. 以最高速離心(2 min)方式風乾後 加入ddH2O或elution buffer
5. 靜置 2 min 等 DF colume 的 filter 吸收
6. 以最高離心將DNA溶出
但所得之DNA濃度很低 僅0.010 ug/ul
260/280 = 2.3 260/230 = 0.1
目前不知道出甚麼問題
純化前跑膠也的確有正確的band (4000 bp)
另外我純化PCR products(600~1000bp)是正常的
使用其他廠牌純化kit也是相似結果
想來請教各位有經驗的前輩
感謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.228
1F：→ ai760721:我覺得純化完 10 ng/ul還滿正常的阿XD 03/13 14:55
2F：→ ai760721:忘記問你是只切一刀 還是切一段下來? 03/13 14:56
3F：→ blence:我覺得你什麼都沒寫,先猜你用100ul,結果就正常 03/13 14:57
4F：→ blence:不過打這麼多字,卻沒有提到你PCR那部分是怎樣的正常 03/13 15:05
5F：→ ayenyayaya:我用10ul回溶 只切一刀 03/13 17:23
6F：→ ayenyayaya:PCR 產物純化後 用20ul回溶都還有0.2 ul/ug 03/13 17:26
7F：→ ayenyayaya:主要是切過的plasmid yeild不到10% 感覺有點疑惑 03/13 17:28
8F：→ ayenyayaya:我有試過一次切10ug的plasmid然後去純化 產量也無提升 03/13 17:29
9F：→ micocat:為何只用10ul回溶？你有看說明書嗎 03/13 18:25
10F：→ blence:如果這10ul是自己決定的,我想猜這實驗從切plasmid就不順利 03/13 18:56
11F：→ ayenyayaya:10 是學長做過是可行的 所以照做 03/13 19:57
12F：→ ayenyayaya:我試過照說明書用50也是一樣 03/13 19:58
13F：→ aceliang:看不太懂是做gel extraction還是單純clean up 03/13 20:19
14F：→ ayenyayaya:gel extraction 跟 clean up 結果都是相同的 03/13 20:45
15F：→ KittyGod:你可以試試看加多點水50-100純化後再風乾 這樣應該可以 03/13 22:15
16F：→ KittyGod:回收比較多 03/13 22:16
17F：推 mesenchymal:可以把步驟六的產物 再回到步驟四做一遍,也就是 03/13 22:22
18F：→ mesenchymal:elution 2次 03/13 22:22
19F：推 milkpa:回溶的時候60-65℃加熱一兩分鐘 03/13 22:30
20F：→ blence:有點好奇既然處理PCR的部分沒問題,又這plasmid換別kit也同 03/13 23:37
21F：→ blence:樣狀況,怎麼會猜測是extraction kit的問題? 標題引導了答案 03/13 23:38
22F：→ blence:而且如果已用了50,卻只先說10ul,只會引導出你已試過的方向 03/13 23:45
23F：→ blence:另外文中的流程跟gel extract差一個W1步驟,這也是模糊的點 03/13 23:48
24F：→ blence:總之現有的嘗試你應該試過不少了,你如何懷疑問題在這kit？ 03/13 23:51
25F：→ xxtomnyxx:你有試過拿純化後的產物去跑膠嗎？load 個 5/10 ul 試試 03/14 09:12
26F：→ ayenyayaya:我文中應該沒說我懷疑kit有問題QQ 03/14 09:23
27F：→ ayenyayaya:是想問說有沒有其他可能可以改善的點 03/14 09:25
28F：→ ayenyayaya:純化後的plasmid 我全load跑膠是啥都看不見 03/14 09:26
29F：→ ayenyayaya:另外感謝上面的建議 我有試過可以提升一點點的產量 03/14 09:30
30F：推 elelith:我有個問題... 為何binding和washing離心的轉速只有6000g? 03/14 10:21
31F：推 bluesnow1122:我用一樣的kit 切完之後會先跑膠 切下之後再回收 03/14 22:03
32F：→ bluesnow1122:離心都是用13000rpm 03/14 22:04
33F：→ bluesnow1122:我的plasmid大小是4.5k 所以回收這個大小是沒問題的 03/14 22:08
34F：→ bluesnow1122:純化後是測不太到 但是loading是有band的 03/14 22:09
35F：推 conective:膠回收可能有問題 沒溶乾淨的話 純化前的量就少了 03/15 03:25
36F：推 conective:膠回收可到70度, 回溶的水65-70度 03/15 03:29
37F：→ ayenyayaya:感謝各位幫助 轉速是按照protocol所做 03/15 08:44
38F：→ ayenyayaya:溶膠與回溶溫度問題有試過了 但無改善 03/15 08:47
39F：→ ayenyayaya:目前我只能重複一直做 做到有成功ligation&transformat 03/15 08:49
40F：→ ayenyayaya:ion 03/15 08:49
41F：→ xxtomnyxx:加 DF 後加熱 60~65℃，每 1 分鐘 vortex 一次直到完全 03/15 14:07
42F：→ xxtomnyxx:溶解，再 vortex 後 spindown，然後放到 4℃ 降溫後再過 03/15 14:08
43F：→ xxtomnyxx:column。 這是我的做法，我之前發現如果融膠後的 DF 溫 03/15 14:10
44F：→ xxtomnyxx:度太高，會讓 DNA 回收的產量減少。 03/15 14:10
45F：→ blence:我說的kit問題是抽kit過程的問題,不是kit本身,你的標題寫著 03/15 17:39
46F：→ blence:DNA extraction kit,內容又附kit流程,當然會引導這個方向 03/15 17:40
47F：→ blence:既然你不覺得kit本身,抽的流程又與PCR一樣,何不探討plasmid 03/15 17:41
48F：→ blence:切之前的濃度,切後的狀況,以及不切,等同濃度直接跑膠純化? 03/15 17:43
49F：→ blence:或許你也可能都試過了就是(只是你文章也沒說試過這些) 03/15 17:47
50F：→ blence:其實第一個推文就寫了,而且做cloning,10ng/ul已經很夠用 03/15 17:52
51F：→ blence:比較覺得怪怪的地方反而是你的PCR竟然純化出4ug,大概只有特 03/15 17:53
52F：→ blence:殊實驗才會這樣,這應該pool很多管吧,一般用途反而怪怪的 03/15 17:55
53F：→ blence:而且你做clone,一般雙切只有10ul,很難避免star activity 03/15 17:57
54F：→ blence:如果RE有千放少,也會擔心切不好;若只是單切,那追求高濃度反 03/15 17:57
55F：→ blence:而造成之後self-ligate的現象增多(尤其你切完沒說有CIP) 03/15 17:58
56F：→ blence:附帶一提,plasmid的4k都是假設切完前後一致,該不會差很多吧 03/15 18:03
57F：推 chaunen:單切一定要做CIP(or AP) 挑過1k顆菌cPCR的路過 03/17 09:45
58F：→ chaunen:老實說, 我切膠純化的回收率不知為啥總是很低25%-40% 03/17 09:47
59F：→ chaunen:OD260/230 時常過高(<1) 初始low melting gel重<300mg 03/17 09:51
60F：→ chaunen:最後wash也兩次 13k rpm 3mins後 還會65度C 乾3mins 03/17 09:52
61F：推 chaunen:有時候水加下去會在膜表面形成水珠 吸不下去 有解嗎QQ? 03/17 09:57
62F：→ blence:只憑回收率太低有太多可能;水無法吸收則是膜太乾了 03/18 00:59
63F：→ satasumi:切膠用的gel先借別人家的不同牌的,看是不是純度不良 03/27 18:47