作者XD7103 ()
看板Biotech
標題[求救] 小片段蛋白表現
時間Tue Feb 11 12:14:45 2014
大家好~
小妹在實驗上遇到一點困難，想請問一下大家><
目前因為實驗上的需求想純化小片段的蛋白
首先將蛋白依domain切成四個部分construct到pET-22b(+) Vector
定序結果都ok
但是利用BL21-CodonPlus Competent Cell表現的結果
只有一段可以表現在上清液，其他三段則是都不表現
目前試過的條件有25度及37度
IPTG的濃度試過0.5mM及1mM
由於是第一次純化，也不是很確定可以再修改那些條件
想請問大家是否有其他的建議
感激不盡!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.239
1F：→ blence:這樣猜是有點蠢...是只有前面第一段會表現,後三段都不表現? 02/11 12:31
2F：→ XD7103:不是耶 是只有第二段表現@@ 02/11 12:38
3F：→ Ianthegood:所以是4個construct四組菌的意思? 02/11 14:59
4F：推 huangsw:先從whole cel lysate看看有沒有你要的分子量 02/11 15:34
5F：→ huangsw:另外要不要找找inclution body的可能性？ 02/11 15:35
6F：→ XD7103:I大~ 沒錯!是有四組菌~~~ 02/11 16:33
7F：→ XD7103:H大~有壓片看過tag，分子量接近的地方都沒有band >< 02/11 16:34
8F：→ milkpa:挑其他clone試試看 02/11 17:12
9F：→ kshsdeck:真的表現不出來的話 只能換vector 試試pET系列的tags 02/11 17:23
10F：→ storm780121:可以試試抓不同表現時間看看 02/11 17:30
11F：推 kg9101266:請問induction時間以及分子量? 02/11 23:31
12F：推 CACALALA:我建議妳換換vector@@ 02/12 09:25
13F：→ XD7103:分子量大約20KD左右，induction時間有試過4小時及18小時 02/12 10:49
14F：→ XD7103:C大~請問一下這個vector不好用嗎？因為有一段ok所以也沒想 02/12 10:51
15F：→ XD7103:過vector可能有問題XD 02/12 10:51
16F：→ Ianthegood:RNA有沒有表現? 02/12 11:59
17F：推 abcm1042:換個vector或是溫度可以低到15度 IPTG 也可以試看看0.1~0 02/13 23:34
18F：→ abcm1042:.3mM 或是你有試看看純化看看會不會有呢? 02/13 23:35
19F：→ abcm1042:frame有沒有對? 02/13 23:36
20F：→ XD7103:Frame是對的~我試了0.1mM IPTG等結果囉~感謝！！ 02/14 18:03