作者martyrtitan (Martyrs)
看板Biotech
標題Re: [求救] WB後壓出來的band很weak
時間Fri Jan 11 09:15:36 2013
※ 引述《jajshigogo (唉唷喂~)》之銘言：
: 最近在做WB, protein濃度已經下到200ug了,
: 結果band還是很weak, 就算是壓tubulin, 也不是很明顯
: 步驟大概是跑完gel將protein transfer到PVDF membrane後,
: 用1:5000下一抗(兩種抗體同時壓, 其中一個是tubulin),
: 室溫作用30-60min, 冰4度o/n,
: 隔天在下二抗, 室溫作用60min,
: 再壓片(1小時和2小時)
: 請問各位大大 是哪裡出了問題?
: 還是因為抗體壞掉了??
蛋白量高不代表一定可以壓得出來
重點在於有沒有轉漬過去
因為tubulin和actin含量很高
所以很容易染出來
拿CBR染一下膠 Poncea S染膜
就知道到底轉漬的完不完全
我自己抓條件 Hoefer 10*10的
450mA 都要20小時才轉的稍為乾淨 (25ug protein cooler 4度)
其實不用擔心有沒有過頭的問題...
我轉到現在還沒有看到在第二片膜上看到明顯的band (墊兩層就可以知道會不會過頭了)
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◆ From: 140.112.98.129
1F：推 hangzer:話說真的會tran過頭嗎? 我每次都看到有人會擔心tran過頭 01/11 10:13
2F：推 jajshigogo:我transfer 100mA 2小時 CBR染膠有出現band 應該不是轉 01/13 11:25
3F：→ jajshigogo:過頭 可能是轉不乾淨? 01/13 11:25
4F：→ martyrtitan:biorad的8*6嗎? 如果band很明顯就是沒過去 01/13 11:39
5F：→ martyrtitan:可是你用到200ug..一定怎麼染都會有 01/13 11:39
6F：→ martyrtitan:用30-50ug試試看 轉乾淨一點 如果還是壓不出來 01/13 11:39
7F：→ martyrtitan:就再加蛋白量 但是要增加轉的時間 01/13 11:40