作者skyofsilver (silversky)
看板Biotech
標題[求救] DCFDA染劑測細胞ROS 但control組卻有螢光
時間Tue Aug 7 22:37:55 2012
小的是使用貼附型HSC-3細胞進行實驗
由於聽說medium及trypsin會影響測出來的螢光表現
所以有幾個步驟是特別去除medium跟trypsin的動作
我的實驗步驟如下:
1. 細胞總共分為四組: 不染染劑, negative control, positive control, 藥物組
2. 藥物組已事先加藥處理24小時, 而positive control則是使用550uM的H2O2處理一個
小時(in medium)
3. 將四組的medium吸除 加入20uM的DCFH-DA染劑 in 含5% FBS的PBS (不染染劑組不加
DCFH-DA) 37度C 30mins
4. 吸掉含染劑之5% FBS PBS 使用PBS wash
5. trypsin打下細胞 加入含0.2% FBS PBS的離心管中
6. 離心完後去上液 回溶 1ml PBS 上機 (流式細胞儀)
不過上機後的Data 將完全不染的組別螢光調至約10^0處時 發現光上negative control
螢光強度就爆衝到約10^3 而之後上positive control, 加藥組 螢光強度也與negative
control幾乎相同
請問發生這種問題是因為染劑問題嗎? 還是因為我的實驗中有哪個步驟出現錯誤呢?
因為negative control就有這麼強的螢光表現實在不太尋常...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 218.173.33.122
1F：→ williamyang:請問有分活死細胞嗎?死細胞的話會有訊號出現 08/07 23:24
2F：→ skyofsilver:沒有特別分耶! 08/08 13:53
3F：→ a001ou:為什麼完全不染的螢光要調到1阿? 不是應該直接拿Control 08/09 03:31
4F：→ a001ou:將訊號調到10^2來看增加還是減少嗎? 08/09 03:32
5F：→ ChesterYeah:活細胞死細胞沒差~是要進到細胞才會有螢光 (DCF-ROS) 08/11 16:47
6F：→ ChesterYeah:頂多是怕 background, washing 要乾淨 08/11 16:48
7F：→ ChesterYeah:也要看你細胞代數, 數量, 還有穩定度 才不會有過多ROS 08/11 16:49
8F：→ ChesterYeah:positive 太低 可能是下太猛了掛光光 Dye 進不去 08/11 16:50
9F：→ ChesterYeah:H2O2 是一個很好的 positive 08/11 16:52
10F：推 ChesterYeah:FBS 不影響 08/11 16:55
11F：→ ChesterYeah:Medium 我用 DMEM F12 也不影響 08/11 16:56
12F：推 bu105330:DISH或者FLASK本身就有螢光喔~建議seeding在玻璃上! 09/05 00:10
13F：→ Yuliangliang: 請問大大之後有找到問題點嗎~? 我最近也為此所苦... 06/13 18:49