作者aggaci (台南工作的基隆人)
看板Biotech
標題Re: [求救] site-directed mutagenesis
時間Wed Nov 16 18:11:23 2011
※ 引述《aggaci (台南工作的基隆人)》之銘言：
※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言：
: 我現在是做A基因的點突變，
: 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
: 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
: 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
: 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
: 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
: 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
: 心想應該行不通
: F1----------> F2--------->
: ------------------------------------------------------
: ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
: ------------------------------------------------------
: R1<---------
: R2<----------
: 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
: 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
: 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
: Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
我的方法不一樣 提供給大家
我的是
P---------m----------->
------------------------------------------------------ m:mutation
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
<---------------P
這樣做PCR 因為沒重疊所以不太會形成primer dimer 會比較好做
要注意的地方在於我的primer尾端會加phosphate
因為這樣做出來是linear DNA所以之後拿去作ligation......
效率不錯!!我覺得比傳統quickchange好做很多
另外我用的是fynzyme的phusion pfu
這pfu超好用 作的 超準 超快 超多
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單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。
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◆ From: 140.116.253.121
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:41)
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:42)
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:43)
1F：推 Ianthegood:推phusion 超貴超好用 11/16 00:35
2F：→ dodomilk:這方法聽起來不錯！ 照你這樣講的話，primer不事先加P應 11/16 01:01
3F：→ dodomilk:該也是可以的，只是之後要多一道PNK的步驟 11/16 01:01
4F：→ aggaci:對阿 要多磷酸化這一步 11/16 01:11
5F：推 micocat:有重疊的好處是不用ligation,pcr完就可以transform了 11/16 01:34
6F：→ micocat:不重疊的話 就是blunt end ligation囉 11/16 01:35
7F：推 mattmatt:phusion+1 上面+1..不用ligation省事很多 11/16 10:14
8F：推 dodomilk:blunt end self ligation超好作的，不可能會失敗... 11/16 11:30
9F：→ aggaci:真的 但不管怎樣 肯定比TWO-STEP pcr好做很多 11/16 11:52
10F：推 silverberry:想請問樓上們，把 plasmid 做一圈出來的方法， 11/16 15:01
11F：→ silverberry:要怎麼確定沒有不小心錯在 plasmid 上? 11/16 15:01
12F：→ silverberry:我們實驗室都很怕死的做 2 step PCR 11/16 15:02
13F：→ silverberry:雖然速度沒有慢很多，但是還是很多步驟。 11/16 15:02
簡單阿
我們lab的做法是 insert 沒錯就好
之後把insert 切下來再接到新的vector上
2 step pcr難用又難做
14F：→ silverberry: 請大家給點建議~~~ 謝謝^^ 11/16 15:03
15F：推 dodomilk:用pfu 11/16 17:30
PFU還是無法保証vector sequence有沒出錯
除非你去對整個vector定序
所以最安全的做法是 把insert 切下來再接到新的vector上
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◆ From: 140.116.253.121
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/16 18:12)
16F：→ lovesteve:我的作法是PCR產物處理DpnI後 產物+PNK+Ligase 在16度2h 11/16 19:12
17F：→ lovesteve:效果也不錯! 11/16 19:13