作者yaliu (雅)
看板Biotech
標題Re: [求救] 限制酶切不好......
時間Fri Aug 27 00:19:35 2010
※ 引述《nurXiah ()》之銘言：
: 最近要把insert換到另一個載體(8kbp)
: insert的部分用相同的限制酶已經切好了 跑膠check size也是對的
: 但用同樣的限制酶去切載體(transform到細菌內大量複製,再抽完plasmid)卻一直切不好
: 兩種限制酶試過作用37度 3h,4h,5h 但要切膠回收時跑出來的band都怪怪的
: 有位置明顯不對的 有跑出好幾條band的(照理說應該是兩條) 也有band上方有拖拖的痕跡
會是質體濃度太濃？？？沒切乾淨？？
沒切成功的質體conformation不同，就會有不同band出現
: 切完膠用kit回收 再跑膠check 出來的都是兩條band(照理來講回收完應該只有一條)
切哪條band呢？確定那條真的是切成功的嗎？
: 限制酶各取1ul 也有用指定的buffer plasmid取30ul/100ul和50ul/60ul
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什麼意思？？
如果你質體用kit抽小量
質體切30ul這麼大量
1ul酵素可能不太有力喔.....說明書上標榜的活性我覺得參考用啦
（不過也要取決於你的濃度啦，因為我質體通常都抽蠻濃的）
因為vector最好確保能夠完全切乾淨
酵素不用太省啦～用多一點（但也有上限喔～忘記不得超過幾%了）
: 可是目前做了6,7次 還是做不出來XD
: 為了怕有離子干擾 elute都是用滅菌過的二次水
: 但爬文後 發現很多人有做純化的動作 實驗室是沒有這樣做 不知道純化的必要性大不大
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你不是已經切膠純化了？？？
: 麻煩經驗豐富的版友給個建議 前面做不出來 後面ligation也不用做了XD
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.117.195.131
1F：推 ararthur:might overdigest? which RE? 30/100是指取用量/回溶量嗎 08/27 01:35
2F：→ ararthur:如果有比較會亂切的RE放太多 切太久有可能會亂切ex EcoRI 08/27 01:37
3F：推 Ianthegood:star activity 5% glycerol? 08/27 07:44
4F：推 chaunen:酵素一般是放在甘油裡的, 切記最後甘油濃度最好小於5% 08/28 00:38
5F：推 nurXiah:30ul/100ul是指限制酶反應總體積100,plasmid取30下去反應 08/28 23:58
6F：→ nurXiah:沒有測plasmid濃度,只有目測......... 08/29 00:01
7F：→ nurXiah:膠上的兩條band size明顯不同,切膠的時候有切對size 08/29 00:03
8F：→ nurXiah:我是用EcoRI 1ul切4小時,這樣會太久嗎?因為沒有前人的經驗 08/29 00:04
9F：→ yaliu:體積都做100ul了，建議提高酵素量，其實如果是我我會用2或3 08/29 01:11
10F：→ yaliu:4小時我覺得不會太久啦～另外，跟你講一下經驗，之前我有用 08/29 01:12
11F：→ yaliu:過某家切膠純化kit，明明切一條，但純化後卻有兩條 08/29 01:12
12F：→ yaliu:切完跑之後大小有很明顯的不同～不過會有濃度的差異 08/29 01:13
13F：→ yaliu:換另一家kit，就沒有兩條了....但是，那段elute的DNA我是用 08/29 01:14
14F：→ yaliu:來做DNA probe的，當然也用它做positive control，結果雜合 08/29 01:14
15F：→ yaliu:完，還真的有弱弱弱弱的band在上面（跑膠沒看到），所以... 08/29 01:15
16F：→ yaliu:或許有可能是kit的問題吧，其實兩個都是（我猜得啦～～） 08/29 01:16
17F：→ yaliu:不然你換套kit看看 08/29 01:16