※ 引述《Imsomniac (小小熱血生科人)》之銘言： : 先自介好了 : 小弟我是大二某生科系的學生 最近開始了生科系的實驗室人生~ : 現在老師給我的課題是:cell culture => transfect(GFP) => western blot : 做了半學期後 我對於一些實驗原理還不是很明白 : 所以想來求救板上的大大們~ 老實說,其實還蠻擔心這是不是你的作業 不過看到很多人的回應,所以就想說獻醜一下 但其實這些你應該自己找資料都找得到才對 或者在未來的上課中都會學到 敝人也是一路到了研究所,才把你的問題分別一點一滴地學起來 : ======================================================================= : 一、作western blot時會用到SDS來使蛋白質依分子量分開，但同時也會讓蛋白質變性。 : 但蛋白質變性後，為何之後的一抗還能辨識目標蛋白質呢? 這問題在你上過生化和免疫學之後,就會懂了,抗原-抗體之間的結合靠得是 抗體辨認抗原上的epitope所決定,而所辨認的epitope關鍵可能有: 1.aa的序列(一級結構) 2.conformation 所以~可以知道,能作western blot(WB)的抗體,一定具有辨認特定aa序列的能力, 所以在蛋白質變性後可以辨認得到 另外一種就是辨認蛋白質特定的構型,在未變性前,某些aa在空間上靠在一起形成epitope 但在變性後,結構改變,空間上就不在一起,此epitope在蛋白變性後便消失了 當然,有些抗體所認的epitope好死不死,不論變性前後,都不受影響 亦即,此epitope是特定aa序列,且在native態時就在最外層,可供辨認 因此這種抗體就可以同時拿來在WB跟immunocytochemistry (ICC)實驗裡使用 : 二、據我查到的資料，牛奶的目的是block membrane中的孔洞，這是什麼意思?? : 如果沒有做這個步驟，最後的照出來的結果會怎麼樣子(重要 我想知道他會長怎樣)? : 還有牛奶不可為加鈣的人工添加牛奶，如果加入了其他東西會怎樣? 有沒有鈣不是最大的重點,最大的重點是"一定要是脫脂奶粉" 我個人是不確定牛奶中鈣的添加是怎麼添加的(ex需要油脂包覆?!) 但~這些添加物都有可能會干擾抗體-抗原的辨識與結合~導致實驗失敗 而我學到的說法是,membrane本身就有吸附蛋白質的能力,在你SDS-PAGE上的蛋白 transfer到membrane上時,其實還有很多空隙是沒有蛋白的,若不用牛奶blocking 同樣也是蛋白質的抗體,也會被吸附上去,而要知道WB中,1抗是很珍貴的 若你不blocking就直接上1抗,被老闆知道了,即使實驗做得出來,也是會被打死的(笑) : 三、transfect方式選擇? : 我看過很多網路的資料，DEAE-dextran的介紹還蠻少的，是因為現在不常用了嗎? : 還有liposome聽說效率較高，適用的細胞株也比較多對嗎? 他有什麼限制? 我沒用過DEAE-dextran,所以我不懂,可能有待高手解答 而說lipo效率高,是同時考量了時間跟金錢來看 不過有些細胞用lipo送效率極差(ex A549細胞), 當然,也有其他非lipo系列的的transfection reagent可以使用(ex CaPO4) 否則以我的實驗經驗來看,把質體送入細胞中,送的量最多的應該是電穿孔的方式 但是機器貴+條件要抓,且隨著電極管使用次數增加,條件又得重抓,很不方便 : 四、Western blot最後的ECL是怎麼讓蛋白質顯影在底片上的? : 我知道底片是因為電子打在上面，使銀離子沉澱，但是什麼發散電子的? : 顯影劑的作用又是什麼? 為什麼兩個容易加在一起才能使蛋白質顯影? 2抗上會皆有HRP (horseradish peroxidase),在代謝peroxide時,會同時代謝掉substrate 而產生冷光,便可以使底片曝光, 另外,個人不會稱呼那2罐為"顯影劑",這會跟洗底片用的"顯影劑"搞混 個人會稱呼為"呈色劑"(雖然他是發光,不是呈色,都亂叫一通~=..=") 你去看ㄧ罐一定是peroxide,另一罐則是substrate 不過,如果你用的是另一套系統,是用AP (Alkaline phosphatase)呈色的話 那就又是another story了~不過我沒用過~所以我不知道原理~(可見我沒作過IHC~XDDDDD) : 五、繼代培養中的EDTA是做什麼用的? : 我知道EDTA能除去鈣離子、鎂離子，但為什麼要除去這兩個? : 還有細胞培養時都是用D_PBS(去除鈣離子、鎂離子的PBS)為什麼? : 細胞不需要鈣離子、鎂離子嗎? 讓細胞能貼附的Extracellular matrix (ECM)中,有的需要鈣離子的結合才能作用 至於鎂離子,抱歉,恕我學藝不精,我不知道哪個ECM的結合是需要鎂離子的 說PBS可以去除,純粹只是因為PBS中沒有Ca2+,以化學角度來說,可以幫助帶走Ca罷了 不然去除Ca2+的主力還是在EDTA上,PBS主要是要去除serum跟其他代謝廢物 : ======================================================== : 大概就這些問題了，謝謝大大們解惑。 --

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