※ 引述《Imsomniac (小小热血生科人)》之铭言： : 先自介好了 : 小弟我是大二某生科系的学生 最近开始了生科系的实验室人生~ : 现在老师给我的课题是:cell culture => transfect(GFP) => western blot : 做了半学期後 我对於一些实验原理还不是很明白 : 所以想来求救板上的大大们~ 老实说,其实还蛮担心这是不是你的作业 不过看到很多人的回应,所以就想说献丑一下 但其实这些你应该自己找资料都找得到才对 或者在未来的上课中都会学到 敝人也是一路到了研究所,才把你的问题分别一点一滴地学起来 : ======================================================================= : 一、作western blot时会用到SDS来使蛋白质依分子量分开，但同时也会让蛋白质变性。 : 但蛋白质变性後，为何之後的一抗还能辨识目标蛋白质呢? 这问题在你上过生化和免疫学之後,就会懂了,抗原-抗体之间的结合靠得是 抗体辨认抗原上的epitope所决定,而所辨认的epitope关键可能有: 1.aa的序列(一级结构) 2.conformation 所以~可以知道,能作western blot(WB)的抗体,一定具有辨认特定aa序列的能力, 所以在蛋白质变性後可以辨认得到 另外一种就是辨认蛋白质特定的构型,在未变性前,某些aa在空间上靠在一起形成epitope 但在变性後,结构改变,空间上就不在一起,此epitope在蛋白变性後便消失了 当然,有些抗体所认的epitope好死不死,不论变性前後,都不受影响 亦即,此epitope是特定aa序列,且在native态时就在最外层,可供辨认 因此这种抗体就可以同时拿来在WB跟immunocytochemistry (ICC)实验里使用 : 二、据我查到的资料，牛奶的目的是block membrane中的孔洞，这是什麽意思?? : 如果没有做这个步骤，最後的照出来的结果会怎麽样子(重要 我想知道他会长怎样)? : 还有牛奶不可为加钙的人工添加牛奶，如果加入了其他东西会怎样? 有没有钙不是最大的重点,最大的重点是"一定要是脱脂奶粉" 我个人是不确定牛奶中钙的添加是怎麽添加的(ex需要油脂包覆?!) 但~这些添加物都有可能会干扰抗体-抗原的辨识与结合~导致实验失败 而我学到的说法是,membrane本身就有吸附蛋白质的能力,在你SDS-PAGE上的蛋白 transfer到membrane上时,其实还有很多空隙是没有蛋白的,若不用牛奶blocking 同样也是蛋白质的抗体,也会被吸附上去,而要知道WB中,1抗是很珍贵的 若你不blocking就直接上1抗,被老板知道了,即使实验做得出来,也是会被打死的(笑) : 三、transfect方式选择? : 我看过很多网路的资料，DEAE-dextran的介绍还蛮少的，是因为现在不常用了吗? : 还有liposome听说效率较高，适用的细胞株也比较多对吗? 他有什麽限制? 我没用过DEAE-dextran,所以我不懂,可能有待高手解答 而说lipo效率高,是同时考量了时间跟金钱来看 不过有些细胞用lipo送效率极差(ex A549细胞), 当然,也有其他非lipo系列的的transfection reagent可以使用(ex CaPO4) 否则以我的实验经验来看,把质体送入细胞中,送的量最多的应该是电穿孔的方式 但是机器贵+条件要抓,且随着电极管使用次数增加,条件又得重抓,很不方便 : 四、Western blot最後的ECL是怎麽让蛋白质显影在底片上的? : 我知道底片是因为电子打在上面，使银离子沉淀，但是什麽发散电子的? : 显影剂的作用又是什麽? 为什麽两个容易加在一起才能使蛋白质显影? 2抗上会皆有HRP (horseradish peroxidase),在代谢peroxide时,会同时代谢掉substrate 而产生冷光,便可以使底片曝光, 另外,个人不会称呼那2罐为"显影剂",这会跟洗底片用的"显影剂"搞混 个人会称呼为"呈色剂"(虽然他是发光,不是呈色,都乱叫一通~=..=") 你去看ㄧ罐一定是peroxide,另一罐则是substrate 不过,如果你用的是另一套系统,是用AP (Alkaline phosphatase)呈色的话 那就又是another story了~不过我没用过~所以我不知道原理~(可见我没作过IHC~XDDDDD) : 五、继代培养中的EDTA是做什麽用的? : 我知道EDTA能除去钙离子、镁离子，但为什麽要除去这两个? : 还有细胞培养时都是用D_PBS(去除钙离子、镁离子的PBS)为什麽? : 细胞不需要钙离子、镁离子吗? 让细胞能贴附的Extracellular matrix (ECM)中,有的需要钙离子的结合才能作用 至於镁离子,抱歉,恕我学艺不精,我不知道哪个ECM的结合是需要镁离子的 说PBS可以去除,纯粹只是因为PBS中没有Ca2+,以化学角度来说,可以帮助带走Ca罢了 不然去除Ca2+的主力还是在EDTA上,PBS主要是要去除serum跟其他代谢废物 : ======================================================== : 大概就这些问题了，谢谢大大们解惑。 --

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