作者ddlittleq (捲頭悶)
看板Biotech
標題[求救] 請教IF泡抗體的問題?
時間Sat May 1 23:20:44 2010
小弟最近著手於IF(immunofluorescence)
最近在做spinal cord的切片染色
看paper上面染NMDA 1&2 receptor 都可以看到完整的neuron型態
但是我怎麼染都只有部分會有接上螢光 200x拍不出paper上那種完整型態
protocol大致上都一樣 除了"permability"的動作沒有
1.H2O2 :抑制鹼性磷酸 酉每; 1hr rt
2.PBS(cold) :wash buffer; 5-10 min/次 rt
3.0.1% Triton+BSA: Blocking; 1hr rt
4.一抗:用3.泡; O/N 4度
5.二抗:用3.泡; 40min-1hr rt 避光
每個步驟中間都會間隔2-3次wash
其實跟網路上面普遍看到的protocol一樣在走
今天看到current protocol
發現他們在泡至一抗或二抗時 他們泡完會"離心" 我以前都沒有做這個步驟
然後我看我實驗室的protocol也沒寫到!!
但是我千真萬卻看到CP上說 這個動作可以"降低背景值"
有沒有板上做IF的神人 可以為小弟指點一下迷津阿
不然我染出來都是背景好深 不然就是染不出像paer上面看到的型態阿
http://yfrog.com/7dimage0003rj 這是GFAP 這樣應該算有染到吧??
然後悲慘的是這個
http://yfrog.com/5mimage0161gj 紅色框框的地方看到的那些小顆小顆的
感覺就像沒特異性一樣ˋ(′_‵||)ˊ
唉
板上的前輩請救救我吧!!!!~~~~~~~~
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如果能贏 誰想輸...
如果能成功 誰想失敗...
如果未來會更好 誰還會停滯不前...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.33.51.84
1F：→ chaunen:2抗離心是因為用2代螢光基(ex:alexa488)的關係吧 05/02 03:13
2F：→ chaunen:解凍會導致螢光物質析出,所以最好離心,以免backgrown上升. 05/02 03:14
3F：→ chaunen:泡1抗改用 0.1% tween20. triton X-100泡太久背景會上升 05/02 03:18
4F：→ chaunen:你可以加做2抗 only 當作backgrown 05/02 03:19
5F：→ chaunen:使用tissue sample本來就多少會吃到一些螢光 05/02 03:20
6F：→ chaunen:所以會希望染到的pattern要有significant(ex:你的GFAP那) 05/02 03:22
7F：→ chaunen:紅色部分, 如果用的是texas red 要注意濾鏡的問題 05/02 03:24
8F：→ chaunen:texas red 看起來應該是桃紅色的 05/02 03:24
9F：→ chaunen:如果你想看那些亮點是不是neuron or glia 05/02 03:26
10F：→ chaunen:可以做double stian 然後用confocal看 05/02 03:27