作者ddlittleq (卷头闷)
看板Biotech
标题[求救] 请教IF泡抗体的问题?
时间Sat May 1 23:20:44 2010
小弟最近着手於IF(immunofluorescence)
最近在做spinal cord的切片染色
看paper上面染NMDA 1&2 receptor 都可以看到完整的neuron型态
但是我怎麽染都只有部分会有接上萤光 200x拍不出paper上那种完整型态
protocol大致上都一样 除了"permability"的动作没有
1.H2O2 :抑制硷性磷酸 酉每; 1hr rt
2.PBS(cold) :wash buffer; 5-10 min/次 rt
3.0.1% Triton+BSA: Blocking; 1hr rt
4.一抗:用3.泡; O/N 4度
5.二抗:用3.泡; 40min-1hr rt 避光
每个步骤中间都会间隔2-3次wash
其实跟网路上面普遍看到的protocol一样在走
今天看到current protocol
发现他们在泡至一抗或二抗时 他们泡完会"离心" 我以前都没有做这个步骤
然後我看我实验室的protocol也没写到!!
但是我千真万却看到CP上说 这个动作可以"降低背景值"
有没有板上做IF的神人 可以为小弟指点一下迷津阿
不然我染出来都是背景好深 不然就是染不出像paer上面看到的型态阿
http://yfrog.com/7dimage0003rj 这是GFAP 这样应该算有染到吧??
然後悲惨的是这个
http://yfrog.com/5mimage0161gj 红色框框的地方看到的那些小颗小颗的
感觉就像没特异性一样ˋ(′_‵||)ˊ
唉
板上的前辈请救救我吧!!!!~~~~~~~~
--
如果能赢 谁想输...
如果能成功 谁想失败...
如果未来会更好 谁还会停滞不前...
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.33.51.84
1F：→ chaunen:2抗离心是因为用2代萤光基(ex:alexa488)的关系吧 05/02 03:13
2F：→ chaunen:解冻会导致萤光物质析出,所以最好离心,以免backgrown上升. 05/02 03:14
3F：→ chaunen:泡1抗改用 0.1% tween20. triton X-100泡太久背景会上升 05/02 03:18
4F：→ chaunen:你可以加做2抗 only 当作backgrown 05/02 03:19
5F：→ chaunen:使用tissue sample本来就多少会吃到一些萤光 05/02 03:20
6F：→ chaunen:所以会希望染到的pattern要有significant(ex:你的GFAP那) 05/02 03:22
7F：→ chaunen:红色部分, 如果用的是texas red 要注意滤镜的问题 05/02 03:24
8F：→ chaunen:texas red 看起来应该是桃红色的 05/02 03:24
9F：→ chaunen:如果你想看那些亮点是不是neuron or glia 05/02 03:26
10F：→ chaunen:可以做double stian 然後用confocal看 05/02 03:27