作者dawzfeminis (S)
看板Biotech
標題[求救] 請問該用TCA或acetone沉澱蛋白?
時間Thu Dec 31 11:42:09 2009
各位前輩
最近操作蛋白沉澱發生了一些問題，想求助各位前輩
我分別用過TCA沉澱與acetone沉澱，雖然兩者皆可以壓到wild type protein,
但在其他WB中預期會看見的bend卻沒看見，更奇怪的是，TCA沉澱看到的bend
在acetone沉澱結果中卻不見了，因此想請問各位前輩的看法
如果作法上有什麼瑕疵的，也請前輩們指正，謝謝!
我的蛋白構築在invitrogen的pSecTag2 vector中
transfect至cos-7細胞表現後，蛋白會被分泌到medium中
我先嘗試以TCA方法沉澱，
medium加入final 20% TCA後，放置冰上10分鐘以沉澱蛋白，14k rpm, 5 min離心
將pellet以acetone wash 兩次後，以95度烘乾，加入pierce的
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 回溶pellet，因無法完全溶解
因此離心後取上清液定量後進行WB
後因TCA沉澱之pellet太難回溶，想改以acetone沉澱
參考的步驟是來自pierce的protocol
http://www.piercenet.com/files/TR0049-Acetone-precipitation.pdf
medium加入final 80% 冰的acetone後，置於-30度5小時，以14k rpm, 10 min離心
將pellet wash後，以50度烘乾，加入pierce的
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 回溶pellet，
雖然以acetone沉澱得到許多pellet，但是卻無法完全溶解，因此同樣是離心後
取上清液定量後進行WB
有想到幾點
想請問，關於acetone沉澱中acetone final 80%，是否有需要改低一點?
還有就是TCA沉澱與acetone沉澱得到的蛋白質或是得到的pellet內含物是否會有所不同?
例如非蛋白質的雜質較多...等
如果還有其他思慮不週的部份，還請各位前輩指出，謝謝!
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◆ From: 140.112.72.94
1F：推 muchmoa:那就合併兩者，TCA用acetone溶，最後一次離心時轉速不用 12/31 15:51
2F：→ muchmoa:太快，都已經沈澱了，10000rpm以下就夠了，所以縮短時間 12/31 15:52
3F：→ muchmoa:這樣pellet就不會太硬，還有沈澱一般都2小時以上吧？ 12/31 15:53
4F：→ missoul:[DTT+lysate]+[aceton+TCA]我的經驗很好溶(condi medium) 12/31 19:11
5F：→ missoul:但是我吸乾或晾乾到沒有液滴就準備溶了 不然太乾 12/31 19:12
6F：→ missoul:乾燥前是先acetone洗3再酒精洗3 (印象中) 12/31 19:13
7F：→ dawzfeminis:目前實驗室是用買來已經溶好的TCA，請問該怎麼再加入 12/31 21:40
8F：→ dawzfeminis:acetone呢？沈澱需要放到-20度之類的嗎？謝謝！ 12/31 21:42
9F：→ dawzfeminis:不好意思！請問condi medium是什麼？我google找不到.. 12/31 21:46
10F：→ dawzfeminis:有看到missoul大之前的推文說是用CHAPS/urea/thiourea 12/31 21:54
11F：→ dawzfeminis:回溶的，請問您說的condi medium是指這個嗎？ 12/31 21:54
12F：→ dawzfeminis:若是，請問配方及濃度我該怎樣才查的到呢？謝謝！ 12/31 21:56
13F：→ muchmoa:沒有要跑2DE的話把CHAPS換成SDS效果應該更好，TCA我們是 01/01 15:49
14F：→ muchmoa:固態的 01/01 15:50