作者nikki0415 (小魚ㄦ~)
看板Biotech
標題[求救] Enzyme digestion 一直切不到但Plasmid PCR有band!!!
時間Thu Oct 22 14:53:27 2009
因為小妹做這個Cloning已經快5個月了...一直都卡在很奇怪的地方
所以想請版上經驗值豐富的大家的幫個忙~>"<
我想要Clone的gene片段大約是600bp
PCR primer是設計了BamHI & XbaI的切位
我先用PCR產物接到T/A cloning vector(promega跟RBC都試過)
接著transform into DH5-apha還有TOP-10也試過
使用藍白篩選及Amp抗生素
挑白色的菌落做colony PCR 接著增殖有P到約600bp的菌
抽Plamid 取40.5ul的DNA + 5ul buffer 2 + 0.5ul BSA
+ 2ul BamHI + 2ul XbaI
37度 overnight . 3小時跟4小時都試過
可是最後跑膠確認時都沒有切下我想要的band...
應該說除了很亮的Plasmid的band之外都沒有其他的band = =
酵素是用NEB的 而且是新買的
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.62.203
1F：推 conective:TA 完有定序嗎 有試過single digestion嗎 10/22 15:03
2F：推 oh:是不是template放太多阿? 10/22 15:03
3F：→ nikki0415:我送定序都定不出來= = single之前有試過 還是不行... 10/22 15:08
4F：→ nikki0415:定序定不出來也很奇怪 明明PCR就有可是廠商都定不出來 10/22 15:10
5F：推 conective:TA完有用TA cite旁的酵素切切看大小對不對嗎？ 10/22 15:11
6F：推 tsubasawolfy:定序跟colony PCR我會相信前者.. 10/22 15:12
7F：→ conective:TA那裡要先搞定確定有新增到你設計的RE切位才能繼續 10/22 15:13
8F：→ conective:P出來的東西大小可能差不多 但沒定序根本不能確定是對的 10/22 15:14
9F：→ conective:酵素新買的出問題機率不大 所以最有可能是TA你沒挑到 10/22 15:14
10F：→ conective:TA用酵素切 有再送定序 定不出來有可能根本挑到接進去的 10/22 15:15
11F：→ nikki0415:感謝大大的建議 我已經用TA上的切位正在試了 10/22 15:39
12F：→ nikki0415:定序的sample我也有先抽plamid做PCR有差不多大小的band 10/22 15:40
13F：→ nikki0415:就是奇怪的是都切不下來... 10/22 15:43
14F：推 smilehong:會不會切位上有甲基化所以切不動 10/22 16:19
15F：→ howeichu:一定只能用這兩個RE嗎?? 可否換一個 BamHI和XbaI容易會 10/22 19:02
16F：→ howeichu:甲基化 B:GGATCC X:TCTAGA 容易產生GATC 10/22 19:04
17F：→ nikki0415:今天用Vector上的EcoRI試了..只切到一管而且大小也不對. 10/22 23:13
18F：→ nikki0415:感謝大家的幫助!!! >"< 10/22 23:13
19F：→ nikki0415:現在老闆叫我再各挑10個菌落抽Plamid作測試 總共三盤... 10/22 23:15
20F：→ nikki0415:所以明天是Plasmid之日 = = 10/22 23:15
21F：推 conective:白菌有多少顆？挑多一點看看呀 有一個中就可以了 10/22 23:22
22F：推 conective:喔 我明白了 總共30顆 10/22 23:26
23F：→ conective:祝你趕快挑到囉 10/22 23:26
24F：推 ksn:EcoRI那邊有點怪，切一刀會產生正確大小的single band，切不到 10/22 23:43
25F：→ ksn:則是位置較低的supercoil form(明顯) 10/22 23:44
26F：→ hchs890843:這看起來怎麼像我們家學妹~~可是我們家學妹才開始2wks 10/23 23:33
27F：→ nikki0415:我從五月底就開始了.... 10/24 00:24
28F：→ nikki0415:ksn大大~我比較笨聽不太懂耶? 哈哈不好意思 10/24 00:25
29F：→ nikki0415:hweichu大大我也發現這個問題了~感謝再沒辦法就換切位囉 10/24 00:27
30F：→ nikki0415:今天抽了30管的Plamid外加一管藍色菌落跑膠發現藍色確實 10/24 00:28
31F：→ nikki0415:都比其他來的小 所以星期一會再試試看用 EcoRI去切 10/24 00:30
32F：→ nikki0415:小女子非常感謝熱情的鄉民們~剛溫阿~結果出來再跟大家報 10/24 00:31
33F：→ nikki0415:告~希望我可以向前邁進...>"< 10/24 00:32
34F：→ nikki0415:昨天忘了上來po結果 10/27 15:12
35F：→ nikki0415:結果竟然藍色的菌落也有切下大小約是我要的片段... 10/27 15:13
36F：→ nikki0415:所以昨天也一併送定序了 又要漫長的等待了= = 10/27 15:13
37F：推 kivan:可以用nebcutter切看看insert內有沒有vector上沒有的切位 11/02 08:51
38F：→ kivan:single cut看看有沒有被切開 11/02 08:52