作者g010377 ()
看板Biotech
標題[求救] A549 cell的trnasfection
時間Sat Sep 12 14:20:45 2009
我是用invitrogen的lipofectamine 2000
在6cm dish中做transfection
條件:
A549 cell confluency>90%
lipofectamine reagent 20ul
pCMV-HA tag-insert cDNA 約10.4kb
送入8ug (8ul, 260/280=1.87)
DMEM+DNA 8ul ->RT 5min
-----> mix RT 20min 慢慢滴入細胞
DMEM+reagent 20ul ->RT 5min
在sreum- and P/S-free 的DMEM中進行transfection
5hr 及 24hr之後換成含serum的medium
換medium後的14hr harvest cell
做western blotting detect HA-tag
都沒有detect到東西= =
有沒有板友可以給些建議
萬分感謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
1F：推 aceliang:>90%不會太多嘛？ 是沒用過lipofectamine，不過14hrs不會 09/12 14:29
2F：→ aceliang:太短嘛？另外A549本身轉染效率就不大好。 09/12 14:29
3F：→ g010377:guideline的建議是90~95% 我也有想過14hr是不是太短 09/12 14:37
4F：→ g010377:但如果有送進去的話 有CMV應該14hr就足夠表現我要的東西 09/12 14:39
5F：推 turtle24:用3T3當positive cell看看送不送得進去 09/12 14:44
6F：推 kaifish:A549的transfection efficiency不太好喔... 09/12 15:01
7F：推 leoblack:A549真的不好transfection,反而黴漿菌污染後效率變好~囧 09/13 08:45
8F：→ tyh0104:use OptiMEM? 09/15 17:35