※ 引述《captdavince (走自己的路)》之銘言： : 各位好 : 不好意思.. : 是一個課業上的問題..但是是星期五結束的討論.很想要知道各位是怎麼做的 : 還請各位包涵 : 我們拿到一張sequence定序的圖.還有wild type的sequence，應該是patient的sample : 然後是已知有問題的sequence，然後就是要我們找到位置.。然後看混淆的sequence : 定序區，然後identify是那一種mutation : 定序用的方法應該是sangers sequencing : 主要就是混淆的sequence中眼睛看確認那個地方是什麼polymorphism然後再比對 : 1.請問一下..如果我這樣做，我怎麼知道那個mutant是從那一股的DNA定到的? : 當時實驗課很趕，所以我只稍微問了一下助教，助教是說一跟wild type比就知道 : 我實際用DNAMAN比一比是把跟wild type比較像的放到同一股上 : 但是這樣不是會有一個問題：在不知道是什麼mutation, inversion, deletion, : insertion的情況下，怎麼知道定序上兩個peak代表的nucleotide是在那一股上? : 2.在看sequence時，大家都是全部輸進電腦裡做multiple alignment然後看嗎? : 還是說都用眼睛看呢? : 3.一些mutation像是deletion, addition或site mutation可以在multiple alignment : 後看得出來，但是像是inversion, frameshift等mutation : 有algorithm可以看得出來嗎? 基本上定序完後，廠商會給兩個檔案 一個是看訊號的強度，一個是訂完的nucleotide序列 我們通常都是將序列輸入倒NCBI進行blast就可以知道 你比對到的相似物種序列，以及方向 當然如果你已知序列的功能或來自的物種，並且有WT的序列 只想知道這兩個序列差異 也可以利用NCBI上面的bl2seq比對一下就可以知道了 什麼樣子的突變就可以知道了，用肉眼看太困難了 : 4.另外一個有關定序的問題想要問一下，在爬文之後發現就是一般要定序都會做TA : cloning : 像這種時候送定序就直接送嗎?不需要給廠商vector的種類跟做cloning用的切位嗎? 送定序看你送什麼樣子的樣本 可以送菌（必須告訴廠商host及抗生素抗性、質體） 也可以送質體（當然要講是哪種質體） 切位不用講 : 好像有些情況也是PCR product確定是single band後也可以定序 : 像這兩種，如果廠商不需要vector的種類，或只是PCR product : 要怎麼選primer呢?如何才能定到? 也可以送PCR產物（要確定是single band），不需講vector種類 送定序除了給sample之外，最重要的是要說以什麼primer定序 如果是廠商有的primer不用附給他們 但如果是自己合成的primer就必須附給廠商 並且告知廠商primer濃度及黏合溫度 primer就送你PCR用的primer即可 : 謝謝各位 --

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