作者raxjimmy (rearrangement)
看板Biotech
標題[討論] RNA抽取和RT-PCR
時間Fri May 1 13:12:48 2009
我們實驗室主要在做基因工程
辛苦了一年才把我要做的酵素純化定序完成
這幾天primer也做好了
要準備開始抽RNA
但是問題來了
因為我們實驗室老闆決定要用trizol抽totalRNA做RT
他是參考其他老師的方法 而且他以前用過trizol比較熟悉
但是我覺得用totalRNA做RT的條件
應該是要先讓目標mRNA的expression level變高才好抽
我參考其他做同樣酵素純化和表現的paper都抽mRNA來做RT
而且無論prokaryote還是eukaryote都會找一個酵素表現最高的條件
誘導細胞表現比較大量的目標mRNA
因為我們做的是植物(不是cell culture) 抽mRNA大多從葉子
我們做的酵素又是代謝水解的酵素
所以一些paper認為應該讓種子發芽之後再萃取酵素和mRNA
我們用的不是種子植物 而是芋頭
所以我想效法別人先讓芋頭發芽 這樣酵素有可能會表現量增加
如果需要比較多的酵素 那表示mRNA的表現量也應該增加了
到時候在取組織抽mRNA
不過老闆決定要抽total 他覺得純化到mRNA只會讓產率變更低
當然先照老闆的做 另外一部分我想自己嘗試
我只是想請教一下
如果目標mRNA表現量並不高的情況下用total RNA做RT-PCR真的可行嗎?
又或著只要mRNA表現量低 無論RT-PCR用total RNA還是純化出mRNA都不會差太多
所以我應該著重在找mRNA表現大量? 那要怎麼確定?
那只看酵素表現準嗎? 只測活性或比活性?
還是要做western定量? 可是我們沒有一抗定量= =
我有點胡言亂語了...
我不想做了出問題在想辦法解決 我想先想好各種可能同步先做
不知道有沒有大大可以跟我討論的Orz
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.13.115.38
1F：推 foxrose:推~芋頭!!真好吃~ :P 05/01 13:20
2F：推 foxrose:像我們做細菌的 沒有辦法把mRNA分出來 就是用total RNA 05/01 13:23
3F：→ raxjimmy:可是做細菌的時候可以做一些medium誘導表現阿>"< 05/01 13:30
4F：→ shaline:1pg就可以做RT-PCR，total RNA應該就夠了~ 05/01 14:56
5F：→ raxjimmy:謝謝 這樣我就安心多了XD 05/01 15:10
6F：推 yaliu:在基因大量表現的時候抽RNA，目標基因會比較多沒錯 05/01 17:34
7F：→ yaliu:只是應該不需要做到mRNA的純化 05/01 17:35
8F：→ yaliu:total RNA去RT-PCR就好了 05/01 17:36
9F：推 zoom8080:表現很少就用real-time吧.... 05/01 18:16
10F：→ raxjimmy:所以抽mRNA通常是blot才會用到摟?? 05/01 18:40
11F：推 tin0101:抽total RNA就可行了..只是純度要好.. 05/02 01:02
12F：推 freyjawei:total RNA+1.. 我用mRNA純化只有在建cDNA Library時... 05/07 10:25
13F：→ raxjimmy:囧rz 感謝各位大大 05/08 10:41