作者bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)
看板Biotech
標題Re: [求救] transform後長不出菌?
時間Thu Apr 30 02:30:27 2009
※ 引述《[email protected] (不時生滅的遊雲)》之銘言：
: > 現在問題出現在
: > 我的insert 和vector ligate 16度C 16hrs後
: > transform 到 DH5alpha 裡都長不出菌來
: > 已經試過兩次了
: > 不知道到裡哪邊出了問題?
: > 麻煩幫我解惑一下
: > 感恩呀~~
: insert與vector的莫爾數比是否為3 : 1 ??
做cloning並沒有什麼魔幻數字 3:1 5:1 7:1...隨便你愛怎麼加都可以
很多人根本連算都沒有算 原則就一個 insert要比vector多
做不出來長不出來 有時候根本不一定是insert或vector的問題
先檢查看看 你的ligase buffer是否還正常?你的ligase是否還有活性?
這些都很簡單就能檢查 你隨便找個vector切一刀讓他去self ligase看看就知道
再來就是 你的compent cell 的效率如何?或許這一批compent cell很糟
又或許放太久了保存不好造成效率很糟 那就要重做一批
檢查這個也很簡單 隨便找個vector拿1 ul做一次transformation就知道
好..假設這些都沒問題
那你就要想看看 你的insert來源是什麼? 你做了什麼處理 ?他還有沒有帶者磷酸根?
(遇過有人把vecotr跟insert都做CIP處理...當然連不起來)
如果沒有 那你需要用kinase去幫他加上磷酸根(感謝指正)
還有 你本身使用的溶液或是水有沒有DNA nuclease的污染?
換一些新的水或是新的溶液 或許就做出來了
cloning做到現在 好像除了第一次初學有算過一次比例..後來都沒再管了..XD
當然原則上是要算一下啦 不過也不用執著於3:1或是什麼數字比例
原則有抓到 後面就是troubleshooting 加油吧
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◆ From: 123.193.192.223
1F：推 yaliu:我從沒算過，要測濃度太麻煩了XD 04/30 04:03
2F：推 bbiioo:恩..作到後來!!都不測了..發現 問題常是出在勝任細胞 04/30 10:02
3F：推 hurdle:應該是用kinase(polynucleotide kinase)加phosphate 04/30 10:28
4F：推 chvkimo:同意樓上 phosphatase是分解磷酸根 04/30 12:40
5F：推 damyr:從來沒算+1 04/30 14:45
6F：→ bluecsky:阿 打錯了 是kinase沒錯 04/30 14:51
※ 編輯: bluecsky 來自: 140.109.32.9 (04/30 14:51)
7F：推 bluehttp:我當初也是transform不出來 整個實驗都做不下去 慘 04/30 21:26
8F：→ bluehttp:結果浪費了好幾個月 還被教授唸.. 04/30 21:26